正天丸對偏頭痛大鼠三叉神經節P2X3受體表達的影響*

白方會,　李　慧，　任志軍，　刁建新，　邱愛珠，　陳寶田△

(1南方醫科大學，廣東 廣州 510515； 2暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院中醫科，廣東 廣州 510220； 3湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412000)

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正天丸對偏頭痛大鼠三叉神經節P2X3受體表達的影響*

白方會1,李慧2，任志軍1，刁建新1，邱愛珠3，陳寶田1△

(1南方醫科大學，廣東 廣州 510515；2暨南大學醫學院附屬廣州紅十字會醫院中醫科，廣東 廣州 510220；3湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412000)

[摘要]目的： 探討正天丸對偏頭痛大鼠三叉神經節P2X3受體表達的影響。方法: SD大鼠隨機分為對照組、偏頭痛組、正天丸組和抑制劑(A-317491)組。給藥7 d后，偏頭痛組、正天丸組和抑制劑組硝酸甘油(10 mg/kg)皮下注射建立偏頭痛大鼠模型，對照組注射等量生理鹽水。觀察各組大鼠行為學表現，造模4 h后取材，采用免疫熒光、Western blot和實時熒光定量PCR方法觀察各組大鼠三叉神經節中P2X3受體表達的變化。結果: 造模后5 min左右各組均出現撓頭、爬籠等行為學表現，對照組大鼠僅開始30 min內出現撓頭和爬籠現象，無耳紅表現，大約2 h 后正天丸組和抑制劑組頭痛行為學表現停止，偏頭痛組大鼠在造模后3 h左右停止。偏頭痛組和對照組相比較，大鼠三叉神經節(trigeminal ganglion，TG)中P2X3受體蛋白和mRNA表達均明顯升高(P<0.05)；正天丸組大鼠TG中P2X3受體蛋白和mRNA表達均明顯低于偏頭痛組(P<0.01)；正天丸組和抑制劑組相比，大鼠TG中P2X3受體蛋白和mRNA表達無明顯差異。結論: 正天丸可抑制偏頭痛發作時TG中P2X3受體的過表達，從而發揮抗偏頭痛的作用。

[關鍵詞]正天丸； 三叉神經節； P2X3受體； 偏頭痛

偏頭痛以發作性單側或雙側頭部中、重度搏動樣頭痛為特點，常伴有惡心、嘔吐，聲、光刺激和日常活動均可使頭痛加重。最新流行病學調查顯示我國偏頭痛年患病率為9.3%[1]，偏頭痛目前治愈率較低，致殘率高，給社會和家庭帶來較大經濟負擔，并嚴重影響患者的生活質量。三叉神經血管系統的激活和致敏是偏頭痛發生的關鍵環節[2]，嘌呤能受體P2X3受體屬于P2X亞家族之一(P2X1～7)[3]，為一種配體門控性非選擇性陽離子通道，可以被細胞外ATP所激活，選擇性高表達于與疼痛相關的感覺神經元上，在三叉神經節(trigeminal ganglion，TG)大、中、小直徑神經元均有豐富表達[4]。偏頭痛發作時，三叉神經P2X3受體作為重要的痛覺信息傳遞介質，表達明顯上調[5]。正天丸作為治療偏頭痛的常用中成藥之一，臨床療效確切且安全性較好，但其作用機制尚缺乏深入探討。本實驗通過觀察正天丸對偏頭痛模型大鼠TG中P2X3受體表達的影響，以探討其對偏頭痛的防治機制。

材料和方法

1實驗動物、分組和偏頭痛模型的建立

雄性SD大鼠體重(280±20)g，40只，由南方醫科大學實驗動物中心提供。按照隨機數字表法將大鼠分為對照組、偏頭痛組、正天丸組和抑制劑組(A-317491組)，每組10只，4只用于免疫熒光檢測，3只用于Western blot檢測，3只用于實時熒光定量PCR。正天丸組給予正天丸灌胃，劑量為1.62 g·kg-1·d-1(藥物劑量根據成人常規每日口服劑量進行換算)，抑制劑組給予A-317491腹腔注射，劑量為0.5 mg/kg(生理鹽水溶解)，對照組和偏頭痛組大鼠給予生理鹽水灌胃(1 mL/d)。各組大鼠連續給藥 7 d。偏頭痛組、正天丸組、抑制劑組大鼠末次灌胃30 min后左肩部皮下注射硝酸甘油注射劑(10 mg/kg)，制備實驗性偏頭痛動物模型，對照組大鼠同期左肩部皮下注射生理鹽水 0.5 mL[6]。造模4 h后取材。

2實驗藥物與試劑

硝酸甘油注射液，北京益民藥業有限公司；正天丸，華潤三九醫藥股份有限公司；P2X3受體抗體(Santa Cruz)；A-317491(Sigma)；免疫熒光 II 抗-山羊抗兔Cy3(南京凱基生物科技發展有限公司)；β-actin抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；BCA試劑盒和ECL發光液(碧云天試劑有限公司)；PVDF膜(Millipore)；TRIzol(Invitrogen)；PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)；SyBrI熒光定量試劑盒、MX3005P熒光定量PCR儀(Stratagene)；IS 2000 MM圖像工作站(Kodak)。

3實驗方法

3.1癥狀行為學觀察觀察造模后各組大鼠耳紅、撓頭、爬籠、煩躁不安等癥狀出現時間、持續時間和各時段內撓頭、爬籠次數。出現以上行為學表現視為造模成功[7]。采用持續時間分段計數的方法，以每30 min作為一個時段進行觀察，根據預實驗情況，確定本實驗觀察時間持續至造模后3 h。頭痛開始以造模后連續撓頭次數超過5次為標志，預示著造模成功，頭痛消失以30 min內撓頭次數低于5次為標志。

3.2免疫熒光法觀察P2X3受體的表達造模4 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，先快后慢，灌注至大鼠尾巴變僵硬。斷頭取雙側TG，放入4%多聚甲醛固定24 h，次日依次放入10%、20%、30%蔗糖脫水至沉底。石蠟包埋切片，片厚約5 μm。切片依次進行烤片、脫蠟、水化、熱抗原修復、滅活內源性過氧化物酶后，滴加5% BSA封閉液封閉，37 ℃恒溫箱中孵育15 min以封閉非特異性抗原。加入 I 抗P2X3受體兔多克隆抗體(1∶500)，4 ℃環境下孵育過夜；PBS漂洗5 min 3次，滴加熒光 II 抗抗兔Cy3(1∶500)，避光孵育1 h， PBS漂洗5 min 3次，加抗淬滅劑，中性樹膠封片，倒置熒光顯微鏡下觀察結果，紅色熒光顆粒為標記的P2X3受體，用圖像分析軟件分析P2X3受體陽性神經元的光密度值變化，對照組以PBS代替 I抗。

3.3Western blot測定P2X3受體蛋白的表達大鼠過深麻醉處死，冰上分離雙側TG，-80 ℃保存。等量混合組內所有樣品，取混合物50 mg進行液氮研磨，加入150 μL RIPA裂解液及1.5 μL PMSF冰上裂解30 min，1 500 r/min, 4 ℃離心15 min。取上清液，BCA法測蛋白濃度。取樣本50 μg進行SDS-PAGE分離，轉于PDVF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST沖洗3次，加入P2X3兔多克隆 I 抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗3次，HRP偶聯的山羊抗兔 II 抗(1∶3 000)室溫孵育l h，ECL化學發光法用IS 2000 MM成像系統進行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0(Kodak)軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內參照，標化各組P2X3受體的蛋白表達量，樣品重復檢測3次，取均值。

3.4實時熒光定量PCR測定P2X3受體的mRNA表達大鼠過深麻醉處死，冰上分離雙側TG，-80 ℃保存。按照試劑盒說明書進行各樣本總RNA的提取，以Oligo(dT)為引物逆轉錄RNA為cDNA，逆轉錄條件為25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。以GAPDH為內參照，檢測P2X3受體的mRNA表達。引物自行設計，由上海英駿生物技術有限公司合成，引物序列如下：P2X3的上游引物序列為5’-TCTTGAGGGTAGGGGATGTG-3’，下游引物序列為5’-CACACCCAGCCGATCTTAAT-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-ATTCTCAGCAATGCATCGAC-3’，下游引物序列為5’-ATGGACTGTGGtcATGAGCT-3’。實時熒光定量PCR反應體系為20 μL(dH2O 7 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、Taq酶10 μL)。PCR反應條件為95 ℃ 10 s;95 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,72 ℃10 s,共45個循環。PCR儀讀取內參照GAPDH和P2X3的循環閾值，采用相對定量法(2-ΔΔCt)計算各樣本P2X3受體mRNA相對表達量。

4統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，首先進行方差齊性檢驗，方差齊時采用單因素方差分析，不齊時采用Welch近似方差分析法進行組間比較;與固定一組進行比較時，采用兩獨立樣本的t檢驗；整體組間比較有差異時，進一步采用Bonferroni 校正的t檢驗法(方差齊時用)或Dunnett’s T3法(方差不齊用)進行各組均數的多重比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1各組大鼠行為學表現

造模后5 min左右，對照組大鼠除開始30 min內撓頭和爬籠現象稍明顯外，其余時段未見明顯異常活動，無耳紅表現。其余各組大鼠均出現雙耳發紅，頻繁撓頭、爬籠及煩躁不安等現象，此現象在造模后30～60 min達高峰，大約2 h 后正天丸組和抑制劑組大鼠出現活動明顯減少，精神不振，蜷臥于觀察箱的一角，偏頭痛組大鼠在造模后3 h左右活動減少，蜷臥不動。

2免疫熒光觀察

免疫熒光結果顯示，各組大鼠TG神經元均有不同程度P2X3受體陽性表達(圖中紅色熒光顆粒)，偏頭痛組表達亮度明顯較對照組高，正天丸組和抑制劑組表達亮度較偏頭痛組降低。各組的陽性神經元光密度值如下：對照組為0.156 6±0.012 6，偏頭痛組為0.331 9±0.024 3，正天丸組為0.167 3±0.011 8，抑制劑組為0.164 0±0.017 9。偏頭痛組P2X3受體表達較對照組升高(P<0.05)，正天丸組和抑制劑組P2X3受體表達低于偏頭痛組(P<0.05)，正天丸組和抑制劑組之間比較差異無統計學顯著性，見圖1。

Figure 1.The effects of Zhengtian pills (ZTP) on the expression of P2X3receptor in the TG of each group observed by immunofluorescence (×200).

圖1各組大鼠TG中P2X3受體的表達

3Western blot測定P2X3受體蛋白表達的結果

各組大鼠TG神經元P2X3受體蛋白表達結果顯示，P2X3/β-actin的比值如下：對照組為0.38±0.04,偏頭痛組為0.95±0.04,正天丸組為0.59±0.02,抑制劑組為0.61±0.04。偏頭痛組P2X3受體蛋白表達較對照組明顯增加(P<0.05)，正天丸組P2X3受體蛋白表達較偏頭痛組明顯降低(P<0.01)，正天丸組P2X3受體蛋白表達與抑制劑組比較差異無統計學顯著性,見圖2。

Figure 2.The effects of ZTP on the protein expression of P2X3receptor in the TG determined by Western blot. Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs model group.

圖2各組大鼠TG中P2X3受體蛋白的表達

4實時熒光定量PCR測定P2X3受體的mRNA表達結果

實時熒光定量PCR結果顯示，各組大鼠TG上P2X3受體的mRNA表達水平如下：對照組為1.00±0.01、偏頭痛組為1.84±0.14、正天丸組為1.40±0.22、抑制劑組為1.29±0.16。偏頭痛組大鼠TG上P2X3受體的mRNA表達較對照組明顯增加(P<0.01)，給予正天丸治療后偏頭痛大鼠TG上P2X3受體的mRNA表達較偏頭痛組明顯降低(P<0.01)，正天丸組P2X3受體的mRNA表達與抑制劑組比較差異無統計學顯著性，見圖3。

Figure 3.The effects of ZTP on the mRNA expression of P2X3receptor in the TG of each group by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.##P<0.01 vs model group.

圖3各組大鼠TG中P2X3受體的mRNA表達

討論

行為學表現是評價硝酸甘油偏頭痛大鼠模型造模成功的一項重要指標[8]，本實驗給予大鼠皮下注射硝酸甘油5 min左右即出現雙耳發紅、頻繁撓頭、爬籠及煩躁不安等現象，說明我們成功復制了偏頭痛模型。我們的結果顯示偏頭痛組大鼠的撓頭、爬籠等行為學表現持續了3 h左右，表明我們所造的偏頭痛模型的頭痛呈一定的持續狀態，與文獻報道和偏頭痛患者臨床表現相符合[9]。給予特異性P2X3受體抑制劑A-314791治療后，患者的行為學表現持續時間明顯縮短，說明P2X3受體確實參與了偏頭痛的發病過程，正天丸治療后頭痛癥狀明顯改善，佐證了其可能通過抑制P2X3受體的表達起作用。

三叉神經血管系統的激活和致敏是偏頭痛發生的關鍵環節。TG作為三叉神經血管系統的重要部位，其周圍突分布在頭、面部以及頸部，將收集到的痛覺信息通過其中樞突傳遞至三叉神經二級神經元——三叉神經脊束核尾部，進一步向中樞傳遞[10]。P2X3受體選擇性高表達于處理傷害性信息的感覺神經元上[11]，具有較高的Ca2+通透性，可以介導包括偏頭痛在內的多種急慢性疼痛，已成為疼痛治療領域的新靶點[12]。P2X3受體在TG神經元有豐富表達，支配硬腦膜的TG神經元有43%呈P2X3免疫陽性[13]。激活三叉神經感覺神經元的P2X3受體可引起Ca2+內流，增加興奮性神經遞質谷氨酸釋放以加強興奮性突觸傳遞，并介導炎癥反應的中樞敏化[14]。應用偏頭痛轉基因模型研究顯示，P2X3受體在野生型小鼠感覺神經元基礎表達較低，但在家族性偏癱型偏頭痛Ⅰ型轉基因模型小鼠三叉神經感覺神經元呈組成型上調狀態[15]；P2X3受體在硝酸甘油偏頭痛大鼠模型TG呈高表達狀態[16]，以上報道充分證實了三叉神經感覺神經元P2X3受體表達上調與偏頭痛發作有明顯相關性[17]。本實驗應用免疫熒光和Western blot技術檢測各組大鼠TG中P2X3受體蛋白的表達，實時熒光定量PCR技術檢測各組大鼠TG中P2X3受體mRNA的表達，結果顯示對照組與模型組大鼠TG中均有P2X3受體蛋白和mRNA的陽性表達，但對照組表達較低，與對照組相比模型組大鼠TG中P2X3受體蛋白和mRNA的表達明顯升高，說明在正常狀態下TG中既有少量P2X3的表達，我們對大鼠皮下注射硝酸甘油成功建造了偏頭痛動物模型，激活了三叉神經血管系統，硝酸甘油可以通過上調TG中P2X3的表達從而介導偏頭痛的發作，與文獻報道一致[5]。

偏頭痛屬于中醫學“頭痛”、“頭風”范疇，其病因病機可概括為風、濕、瘀、虛4個方面。正天丸正是根據此病因病機，由導師陳寶田教授于1985年創制而成，該方由川芎、鉤藤、白芍、生地黃、當歸、桃仁、紅花、白芷、麻黃、附子、細辛、防風、羌活、獨活、雞血藤等中藥組成，具有疏風活血、養血平肝、通絡止痛等功效，是目前臨床治療偏頭痛的常用中成藥之一[18]，已在臨床應用20多年，并已遠銷海外。臨床隨機對照雙盲多中心研究顯示，正天丸能顯著減輕偏頭痛的發作強度、程度，降低發作頻率，縮短頭痛持續時間，臨床療效確切，病人耐受性好，且無明顯不良反應[19]。實驗研究顯示正天丸對偏頭痛大鼠癥狀行為學的改善有類似氟桂利嗪樣作用[8]，正天丸的鎮痛作用與其可以升高實驗動物血及腦干中5-羥色胺水平，降低血漿中降鈣素基因相關肽、一氧化氮含量等多種疼痛遞質有關[8, 20]。本研究結果顯示，與偏頭痛組相比，正天丸組和抑制劑組大鼠TG中P2X3受體mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，正天丸組和抑制劑組之間比較無差異，說明正天丸可以通過抑制偏頭痛發作時TG中P2X3受體的過表達從而發揮抗偏頭痛的作用，從而為正天丸治療偏頭痛的作用機制提供了新的依據。

[參考文獻]

[1]Yu S, Liu R, Zhao G, et al. The prevalence and burden of primary headaches in China: a population-based door-to-door survey[J]. Headache, 2012, 52(4):582-591.

[2]Goadsby PJ, Charbit AR, Andreou AP, et al. Neurobiology of migraine[J]. Neuroscience, 2009, 161(2):327-341.

[3]蘇程程，張譯丹，馬永強，等. 干擾P2X7R基因對RAW264.7細胞增殖和吞噬的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(11):2065-2069.

[4]Kim YS, Paik SK, Cho YS, et al. Expression of P2X3receptor in the trigeminal sensory nuclei of the rat[J]. J Comp Neurol, 2008, 506(4):627-639.

[5]Hautaniemi T, Petrenko N, Skorinkin A, et al. The inhibitory action of the antimigraine nonsteroidal anti-inflammatory drug naproxen on P2X3 receptor-mediated responses in rat trigeminal neurons[J]. Neuroscience, 2012, 209:32-38.

[6]Maniyar FH, Sprenger T, Monteith T, et al. Brain activations in the premonitory phase of nitroglycerin-triggered migraine attacks[J]. Brain, 2014, 137(Pt 1):232-241.

[7]張慧，李冬霞，栗志勇，等. 芎芷石膏湯對硝酸甘油致偏頭痛大鼠血漿NO、NOS、CGRP及腦中5-HT、 5-HIAA含量的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(17):175-180.

[8]李濤，范吉平，曹克剛，等. 正天丸對多巴胺、硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠模型腦干神經遞質影響[J]. 中華中醫藥雜志, 2014, 29(2):444-446.

[9]Romero-Reyes M, Akerman S. Update on animal models of migraine[J]. Curr Pain Headache Rep, 2014, 18(11):462.

[10]王先紅，田苗苗，潘晴晴，等. 丘腦前核在三叉神經電刺激減輕癲癇發作和海馬神經元損傷中的作用[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(12):2249-2253.

[11]王海華，姜玉新，王靜，等. 心包腔注入炎性滲出液誘導大鼠三叉神經脊束核神經元c-Fos表達[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(11):1921-1928.

[12]Wirkner K, Sperlagh B, Illes P. P2X3 receptor involvement in pain states[J]. Mol Neurobiol, 2007, 36(2):165-183.

[13]Staikopoulos V, Sessle BJ, Furness JB, et al. Localization of P2X2 and P2X3 receptors in rat trigeminal ganglion neurons[J]. Neuroscience, 2007, 144(1):208-216.

[14]Chiang CY, Zhang S, Xie YF, et al. Endogenous ATP involvement in mustard-oil-induced central sensitization in trigeminal subnucleus caudalis (medullary dorsal horn)[J]. J Neurophysiol, 2005, 94(3):1751-1760.

[15]Hullugundi SK, Ferrari MD, van den Maagdenberg AM, et al. The mechanism of functional up-regulation of P2X3 receptors of trigeminal sensory neurons in a genetic mouse model of familial hemiplegic migraine type 1 (FHM-1)[J]. PLoS One, 2013, 8(4):e60677.

[16]劉斌，王彩霞，符艷松. 頭痛寧膠囊對偏頭痛模型大鼠三叉神經節P2X3 mRNA表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2011, 17(19):188-190.

[17]Burnstock G. Physiopathological roles of P2X receptors in the central nervous system[J]. Curr Med Chem, 2015, 22(7):819-844.

[18]李濤, 范吉平, 曹克剛. 正天丸組方配伍及功效特點解析[J]. 中醫藥導報, 2013, 19(6):65-66.

[19]王勇，袁燦興，商洪才，等. 正天丸治療偏頭痛隨機對照雙盲雙模擬多中心臨床研究[J]. 中成藥, 2012, 34(5):791-794.

[20]劉慧蘭，曹克剛，高永紅，等. 正天丸對偏頭痛大鼠的預防作用及對神經遞質的影響研究[J]. 北京中醫藥大學學報, 2008, 31(11):745-747.

(責任編輯： 盧萍， 羅森)

Effect of Zhengtian pills on P2X3receptor expression in trigeminal gan-glion of migraine rats

BAI Fang-hui1, LI Hui2, REN Zhi-jun1, DIAO Jian-xin1, QIU Ai-zhu3, CHEN Bao-tian1

(1Southern Medical University, Guangzhou 510515, China;2Department of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou Red Cross Hospital Affiliated to School of Medicine, Jinan University, Guangzhou 510220, China;3Hunan Traditional Chinese Medical College, Zhuzhou 412000, China. E-mail: gy33mail@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of Zhengtian pills on P2X3 receptor expression in trigeminal ganglion (TG) of migraine rat. METHODS: Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into control group, migraine group, Zhengtian pills (ZTP) group and A-317491 group. After given corresponding drugs for 7 d, migraine rat model was established by subcutaneously injection of nitroglycerin (10 mg/kg), while the control rats were injected with saline. The beha-vioral manifestations of the rats were observed. The expression of P2X3 receptor in rat TG was detected by the methods of immunofluorescence, Western blot and rea-time PCR. RESULTS: About 5 min after subcutaneousl injection, the behavioral manifestations such as scratching head and climbing cage were observed. The behavioral manifestations were observed within the first 30 min in control group, but the erythroid ears did not appear. After 2 h of molding, the behavioral manifestations disappeared in ZTP group and A-317491 group, while those in migraine group lasted for 3 h. Immunofluorescence results showed that the expression of P2X3 receptor in TG was positive in each group. The expression level in migraine group was significantly higher than that in other groups. The P2X3 receptor protein and mRNA levels in the TG of migraine group were higher than those in control group (P<0.01), while those in ZTP group were lower than those in migraine group (P<0.01). No difference of the P2X3receptor expression between ZTP group and A-317491 group was observed. CONCLUSION: Zhengtian pills may effectively alleviate migraine by inhibiting the expression of P2X3receptor in TG.

[KEY WORDS]Zhengtian pills; Trigeminal ganglion; P2X3receptor; Migraine

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0923- 05

[收稿日期]2016- 01- 28[修回日期] 2016- 03- 20

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81202687)；廣東省科技計劃(No. 2012B061700018)；廣東省中醫藥管理局科研課題(No. 20141218)

通訊作者△Tel: 020-61641672; E-mail: gy33mail@126.com

[中圖分類號]R743.9; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.026

雜志網址： http://www.cjpp.net