NVP-BEZ235誘導多囊腎大鼠膽管上皮細胞自噬的機制研究*

葉　晶,　劉特思,　金賢國,　樸英實,　趙元媛，　韓晶邑，　林貞花，　原田憲一，　任香善△

(1延邊大學醫學院病理學教研室， 2延吉市中醫醫院消化內科，吉林 延吉 133000； 3金澤大學醫學部病理學教研室，日本 金澤 9208640)

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NVP-BEZ235誘導多囊腎大鼠膽管上皮細胞自噬的機制研究*

葉晶1▲,劉特思1▲,金賢國2,樸英實1,趙元媛1，韓晶邑1，林貞花1，原田憲一3，任香善1△

(1延邊大學醫學院病理學教研室，2延吉市中醫醫院消化內科，吉林 延吉 133000；3金澤大學醫學部病理學教研室，日本 金澤 9208640)

[摘要]目的： 探討PI3K/Akt/mTOR雙靶點抑制劑NVP-BEZ235誘導多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠膽管上皮細胞自噬的作用。方法: 免疫組化法檢測p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠膽管上皮細胞中的水平。WST-1比色法檢測NVP-BEZ235對膽管細胞活力的抑制作用以及LC3、Beclin 1基因沉默和自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)對細胞活力的影響。蛋白免疫印跡法檢測NVP-BEZ235對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白及自噬標志蛋白LC3和Beclin 1的變化。結果: p-mTOR和p-Akt在PCK大鼠膽管上皮細胞中顯著升高，NVP-BEZ235可明顯抑制膽管上皮細胞的活力，且呈濃度和時間依賴性改變(P<0.05)；NVP-BEZ235明顯抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的水平；并上調自噬標志蛋白LC3 II/LC3 I比值和Beclin 1蛋白的表達水平。LC3、Beclin 1 基因沉默和3-MA均可明顯減弱NVP-BEZ235對細胞活力的抑制作用(P<0.01)。結論: NVP-BEZ235可抑制PCK大鼠膽管上皮細胞的活力，其機制與自噬密切相關。

[關鍵詞]自噬； PI3K/Akt/mTOR信號通路； 多囊腎； NVP-BEZ235

多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠為Caroli病的動物模型，常表現為多發性膽管囊狀擴張和肝門靜脈纖維化[3]。Caroli 病的膽管上皮細胞過度增殖是導致膽管囊狀擴張的主要機制之一[4-5]。而磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號通路參與和調節細胞的增殖、凋亡、自噬等重要的細胞信號轉導，其異常活化引起包括乳腺癌、宮頸癌、肺癌、胃癌等多種疾病的發生[6-9]。蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是PI3K的主要下游效應分子之一。研究發現，ARPKD患者的腎臟和肝臟中Akt、mTOR、S6等蛋白的磷酸化水平異常增高，因此該信號通路的異常活化是ARPKD發生的主要機制[10]。NVP-BEZ235是一種新型的PI3K/mTOR 雙靶向抑制劑[11]，在多種腫瘤中通過誘導細胞凋亡和自噬抑制細胞的增殖[12-13]，但國內尚未見NVP-BEZ235與ARPKD治療方面的研究。

本研究旨在明確NVP-BEZ235對細胞生長和自噬的影響，闡明其相關機制，為Caroli病的臨床治療提供實驗依據。

材料和方法

1材料

1.1試劑與抗體NVP-BEZ235(Selleck Chemicals)溶于DMSO中；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA; Calbiochem)；Alexa-488熒光 II 抗以及Akt、p-Akt(Ser473)、S6、p-S6(Ser235/236)、mTOR、p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、4E-BP1、p-4E-BP1(Thr37/46)、LC3、Beclin 1抗體(CST)；β-actin抗體(Abcam)。

1.2組織標本正常和PCK大鼠肝組織蠟塊由日本金澤大學病理學教研室提供。10月齡大鼠的肝組織取出后，浸泡在4%甲醛緩沖液(pH 7.4)中進行固定，經石蠟包埋處理后，將蠟塊切成4 μm厚的切片，備免疫組化染色用。

2主要方法

2.1細胞培養正常和PCK大鼠膽管上皮細胞由日本金澤大學病理學教研室提供。細胞培養用DMEM/F-12培養液(含10% 胎牛血清、5 μmol/L 毛喉素、20 μmol/L表皮生長因子和1% 青-鏈霉素)，于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養。

本研究采用真假詞識別和褒貶判斷兩個任務揭示了社群性和能動性信息加工過程的ERP特征。研究結果表明，個體對社群性詞語的識別和褒貶判斷要快于能動性詞匯。在詞語識別任務中社群性詞匯誘發的N400潛伏期較長，而兩類詞匯誘發的波幅大小沒有差異；在褒貶判斷任務中社群性詞匯誘發的N400波幅較小，兩類詞匯誘發的潛伏期不存在差異。

2.2免疫組織化學染色免疫組化染色采用EnVision法，切片常規脫蠟，梯度乙醇入水，抗原修復分別用10 mmol/L枸櫞酸鹽檸檬酸鈉緩沖劑(pH 6.0)微波加熱20 min或乙二胺四乙酸(EDTA，pH 9.0)高壓加熱，p-mTOR (Ser2448)(1∶200)和p-Akt(1∶25) I 抗4 ℃過夜。 II 抗室溫孵育30 min，二甲基聯苯胺(DAB)顯色，蘇木素核染，中性樹脂封片。

2.3免疫蛋白印跡實驗0、10、50、100 nmol/L NVP-BEZ235處理PCK大鼠膽管上皮細胞24 h，用T-PER蛋白提取液(Pierce)提取細胞總蛋白，40 μg蛋白經4%～12% 梯度膠電泳，電轉至硝酸纖維膜，加 I 抗[Akt(1∶1 000)、p-Akt (1∶1 000)、S6(1∶500)、p-S6 (1∶500)、4E-BP1(1∶1 000)、p-4E-BP1(1∶1 000)、LC3(1∶500)和Beclin 1(1∶500)]4 ℃過夜，加HRP標記 II 抗室溫孵育30 min，DAB顯色。

2.4LC3和Beclin1基因沉默實驗LC3和Beclin1的siRNA和陰性對照均購自于Qiagen。siRNA轉染使用HiPerFect轉染試劑，具體實驗步驟依據試劑盒說明進行。用標準培養液培養PCK大鼠膽管上皮細胞24 h后換成DMEM/F-12培養液、siRNA(10 nmol/L)和3 μL HiPerFect轉染試劑液的混合液，繼續培養72 h。

2.5WST-1比色法用NVP-BEZ235藥物之前，加入500 nmol/L 3-MA預處理PCK大鼠膽管上皮細胞1 h，再用100 nmol/L NVP-BEZ235與500 nmol/L 3-MA 共同處理細胞24 h，細胞活力用WST-1 比色法測定，按照試劑盒使用說明書操作。

2.6免疫熒光染色細胞接種于8孔熒光染色載玻片，NVP-BEZ235(100 nmol/L)處理24 h，用4% 多聚甲醛固定，用1% 的Triton X-100處理 10 min，血清封閉，加入LC3抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜，加10 μg/L Alexa-488，DAPI染細胞核。

3統計學處理

實驗數據應用Prism 5.0統計學軟件進行處理。所有數據使用均數±標準差(mean±SD)表示；兩組間數據比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1在PCK大鼠膽管上皮細胞中p-mTOR和p-Akt蛋白水平增高

10月齡大鼠肝組織免疫組化染色示，p-mTOR蛋白陽性顆粒位于肝細胞和膽管細胞的細胞核和細胞漿，p-Akt蛋白主要位于肝細胞和膽管細胞的細胞核。這2種蛋白在正常大鼠膽管上皮細胞中顯色較弱，而在PCK大鼠膽管上皮細胞顯色較強，見圖1。

Figure 1. The p-mTOR and p-Akt in the bile duct epithelial cells were examined by immunohistochemistry. In the pictures, the arrows showed the interlobular bile ducts of normal rats and PCK rat dilated bile ducts (×400).

圖1PCK大鼠膽管上皮細胞中的p-mTOR和p-Akt蛋白

2NVP-BEZ235 抑制膽管上皮細胞活力

0、10、50和100 nmol/L NVP-BEZ235 分別作用正常和PCK大鼠膽管上皮細胞24 h、72 h和120 h后發現，NVP-BEZ235組與對照組相比可顯著抑制膽管上皮細胞活力，且在同一時間內，隨藥物濃度增加其抑制效果更明顯，呈濃度和時間依賴性改變(P<0.05)，見圖2A。

Figure 2. The effect of NVP-BEZ235 on viability of cholangiocytes detected by WST-1 assay (A) and the effect of NVP-BEZ235 on the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes detected by Western blot (B). Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs 0 nmol/L group；#P<0.05 vs 10 nmol/L group;&P<0.05 vs 50 nmol/L group.

圖2不同濃度NVP-BEZ235對細胞活力及PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白水平的影響

3NVP-BEZ235 下調PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白的水平

不同濃度NVP-BEZ235 處理PCK大鼠膽管上皮細胞24 h后，p-mTOR(Ser2448)、p-mTOR(Ser2481)、p-Akt、p-S6和p-4E-BP1蛋白水平明顯下降，且呈劑量依賴性改變，NVP-BEZ235在100 nmol/L時，其抑制效果最為明顯(P<0.05)，見圖2B。

4NVP-BEZ235誘導PCK大鼠膽管上皮細胞自噬

蛋白免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3和Beclin 1蛋白表達結果顯示，與對照組相比，NVP-BEZ235作用PCK大鼠膽管上皮細胞24 h后，LC3 II/ LC3 I比值逐漸升高，表明NVP-BEZ235 能夠誘導細胞內自噬活性。Beclin 1蛋白表達水平也隨藥物濃度的增加逐漸增高(P<0.01)。LC3免疫熒光染色結果顯示，100 nmol/L NVP-BEZ235處理的PCK大鼠膽管上皮細胞的胞漿中用藥組LC3 陽性顆粒數量均明顯增加(P<0.05),見圖3。

Figure 3. Effect of NVP-BEZ235 on the autophagy of PCK rat cholangiocytes.A: the PCK cells treated with different concentrations of NVP-BEZ235 for 24 h, and then LC3 II/I ratio and Beclin 1 were significantly increased; B: the protein expression of LC3 increased in the PCK rat cholangiocytes treatment with NVP-BEZ235 (immunofluorescence staining,×400). Mean±SD. n=3～4.*P<0.05,**P<0.05 vs 0 nmol/L group.

圖3NVP-BEZ235對PCK大鼠膽管上皮細胞自噬的影響

5LC3、Beclin1 siRNA和3-MA可明顯逆轉NVP-BEZ235對PCK大鼠膽管上皮細胞活力的抑制效應

LC3和Beclin1基因沉默方法干擾PCK大鼠膽管上皮細胞72 h，免疫熒光染色方法示LC3基因沉默后細胞漿內綠色熒光顆粒(LC3陽性顆粒)明顯減少(P<0.05)，見圖4A。蛋白免疫印跡法顯示，Beclin1 基因沉默的細胞Beclin1表達顯著下調，說明siRNA干擾有效(P<0.05),見圖4B。LC3和Beclin 1siRNA對膽管上皮細胞的活力影響甚微，而與NVP-BEZ235共同處理可顯著逆轉NVP-BEZ235對細胞活力的抑制效果(P<0.01)，見圖4C。0.5 μmol/L 3-MA本身對PCK膽管上皮細胞活力的影響甚微，但與NVP-BEZ235共同處理后，NVP-BEZ235對細胞活力的抑制效果顯著逆轉(P<0.01)，見圖4D。上述結果提示NVP-BEZ235誘導的自噬是抑制PCK膽管上皮細胞生長的主要機制。

Figure 4. Effects of LC3 siRNA, Beclin 1 siRNA and 3-MA on the viability of PCK rat cholangiocytes inhibited by NVP-BEZ235. A: the results of immunofluorescence showed the silencing of LC3 for 72 h; B: the results of Western blot showed the silencing ofBeclin1 for 72 h; C: WST-1 assay determined the effect ofLC3 siRNA orBeclin1 siRNA for 72 h and NVP-BEZ235 for 48 h together on the viability of the cholangiocytes; D: WST-1 assay determined the effect of 3-MA and NVP-BEZ235 together for 48 h on the viability of in the cholangiocytes. Mean±SD. n=3～6.*P<0.05,**P<0.01 vs negative siRNA group;△△P<0.01vsNVP-BEZ235+negative siRNA group;##P<0.01 vs NVP-BEZ235 group.

圖4RNA干擾LC3、Beclin1基因表達和自噬抑制劑3-MA對NVP-BEZ235抑制細胞活力的影響

討論

PI3K/Akt/mTOR 信號傳導通路參與調節細胞的增殖、凋亡、自噬等生物學功能，是抗腫瘤藥物研發的一個潛在靶點。NVP-BEZ235作為PI3K/Akt/mTOR的靶向抑制劑已用于多種腫瘤的治療。魏娟等[14]研究發現，NVP-BEZ235可通過抑制 mTOR 信號通路誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌HepG2細胞的增殖及轉移。NVP-BEZ235不僅誘導細胞凋亡，亦可引起細胞自噬。Yothaisong等[15]研究中表明，NVP-BEZ235可通過下調Akt/mTOR 通路誘導細胞自噬，抑制膽管上皮細胞的增殖。在本研究中，PCK大鼠膽管上皮細胞中磷酸化Akt 和磷酸化mTOR 水平增高，提示Akt/mTOR 信號通路的活化是導致PCK大鼠膽管上皮細胞過度生長的機制之一。

自噬與人類腫瘤的發生、發展密切相關，并影響腫瘤進程、腫瘤細胞凋亡及抗腫瘤治療等。mTOR是調控細胞自噬的重要通路。曹錦霞等[16]的研究表明，EGCG可通過mTOR通路誘導PC12細胞凋亡和自噬，從而抑制細胞增殖。謝彪等[17]的研究也提示，5-Aza誘導胃癌細胞自噬和凋亡，進而抑制細胞增殖。本文為進一步闡明NVP-BEZ235誘導PCK大鼠膽管上皮細胞發生自噬的分子機制, 對Akt/mTOR 信號通路中一些關鍵蛋白的變化進行了檢測。結果表明，NVP-BEZ235呈濃度依賴性地抑制Akt 及其下游靶蛋白mTOR、S6以及4E-BP1蛋白的磷酸化，但其總蛋白無變化，提示NVP-BEZ235僅抑制Akt/mTOR 信號通路關鍵蛋白的活化。

自噬發生后，LC3 I和磷脂酰乙醇胺偶聯形成LC3 II，因此LC3 I向LC3 II的轉變代表了自噬的誘導。本研究用NVP-BEZ235處理細胞后，LC3 II/LC3 I 比值逐漸增高，另一自噬標識蛋白Beclin 1蛋白表達量也隨藥物濃度增高而增高，說明NVP-BEZ235可誘導PCK大鼠膽管上皮細胞的自噬。

為了反證NVP-BEZ235誘導的自噬在抑制膽管上皮細胞生長中的機制，本研究觀察了LC3、Beclin1基因沉默和自噬抑制劑3-MA對膽管上皮細胞活力的影響。結果發現自噬相關基因沉默和3-MA本身對細胞活力影響甚微，但可顯著逆轉NVP-BEZ235對細胞活力的抑制效應，提示誘導細胞自噬是其主要機制之一。LC3、Beclin1基因沉默和3-MA 雖然明顯逆轉NVP-BEZ235對細胞活力的抑制作用，但并沒有完全逆轉，說明除自噬外，其它死亡方式亦可能存在。

綜上所述，PCK大鼠膽管上皮細胞過度生長與PI3K/mTOR 通路被異常激活相關。NVP-BEZ235通過誘導細胞自噬抑制膽管上皮細胞活力，提示NVP-BEZ235 有望成為Caroli病的治療藥物。

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(責任編輯： 盧萍， 羅森)

NVP-BEZ235 induces autophagy of polycystic kidney rat cholangiocytes

YE Jing1, LIU Te-si1, JIN Xian-guo2, PIAO Ying-shi1, ZHAO Yuan-yuan1, HAN Jing-yi1, LIN Zhen-hua1, HARADA Kenichi3, REN Xiang-shan1

(1Department of Pathology, Yanbian University Medical College,2Department of Gastroenterology, Yanbian Hospital of Traditional Chinese Medicine, Yanji 133000, China;3Department of Pathology, School of Medical Sciences, Kanazawa University, Kanazawa 9208640, Japan. E-mail: renxsh@ybu.edu.cn)

[ABSTRACT]AIM: To explore the effect of dual PI3K/Akt/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 on autophagy of polycystic kidney (PCK) rat cholangiocytes. METHODS: The protein levels of p-mTOR and p-Akt in the bile duct epithelial cells were examined by immunohistochemistry. The effect of NVP-BEZ235 on the viability of cholangiocytes was detected by WST-1 assay. The levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway and autophagy-related proteins with NVP-BEZ235 treatment were determined by Western blot. The effects of LC3 and Beclin 1 silencing, and authophagy-specific inhibitor 3-methyladenine (3-MA) on the cell viability were analyzed by WST-1 assay. RESULTS: The protein levels of p-Akt and p-mTOR were highly increased in the bile duct epithelium of the PCK rats. NVP-BEZ235 significantly inhibited the viability of the cholangiocytes in a dose- and time-dependent manner (P<0.05). NVP-BEZ235 significantly reduced the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes. NVP-BEZ235 upregulated the autophagy-specific proteins LC3 II and Beclin 1. The inhibitory effect of NVP-BEZ235 on the cell viability was weakened by treatment with 3-MA and knockdown of LC3 and Beclin 1 (P<0.01).CONCLUSION: The PI3K/Akt/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 suppresses the viability of PCK rat cholangiocytes, and the mechanism is closely related with autophagy.

[KEY WORDS]Autophagy; PI3K/Akt/mTOR signaling pathway; Polycystic kidney; NVP-BEZ235

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0886- 06

[收稿日期]2015- 11- 23[修回日期] 2016- 03- 03

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 413010033)；延邊大學自然科學基金資助項目(No. 602013109)

通訊作者△Tel: 0433-2435092; E-mail: renxsh@ybu.edu.cn

[中圖分類號]R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.020

雜志網址： http://www.cjpp.net

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