OrexinA、OrexinB和 AMH受體在性腺軸的分布及其生殖生物學意義的研究

海米提?阿布都力木李 艷郭 瓊榮小靈李 甜阿地力江?伊明

1. 新疆醫科大學基礎醫學院組胚教研室（烏魯木齊 830011）；

2. 新疆醫科大學第二附屬醫院檢驗科；3. 新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學研室

·論 著·

OrexinA、OrexinB和 AMH受體在性腺軸的分布及其生殖生物學意義的研究

海米提?阿布都力木1李 艷1郭 瓊1榮小靈2李 甜1阿地力江?伊明3*

1. 新疆醫科大學基礎醫學院組胚教研室（烏魯木齊 830011）；

2. 新疆醫科大學第二附屬醫院檢驗科；3. 新疆醫科大學基礎醫學院人體解剖學研室

目的研究食欲素受體1（OX1R）、食欲素受體2（OX2R）、抗中腎旁管激素受體Ⅱ（AMHR2）在下丘腦-垂體-睪丸軸中分布與細胞定位，探討其對生精功能的調節機制。方法用免疫組織化學法檢測OX1R，OX2R和AMHR2受體在性未成熟和性成熟SD大鼠的下丘腦、垂體、睪丸表達情況。結果性未成熟組：OX1R，OX2R和AMHR2受體在下丘腦室周帶、內側帶、外側帶神經元細胞質及細胞膜表達陽性，在腺垂體少數細胞細胞質陽性，在睪丸只有間質細胞細胞膜及細胞質表達陽性。性成熟組：OX1R、OX2R和AMHR2受體在下丘腦室周帶、內側帶、外側帶神經元細胞質及細胞膜表達陽性，在腺垂體少數細胞細胞質陽性，在睪丸間質細胞和精原細胞細胞膜及細胞質表達陽性。結論OX1R、OX2R和AMHR2受體在性成熟與未成熟的大鼠下丘腦、腦垂體表述無差異，在睪丸分布上具有不同，上述3種受體可能參與性腺軸調節精原細胞分化功能。

食欲素受體; 中腎旁管激素受體; 大鼠, Sprague-Dawley; 萊迪希細胞; 精原細胞

1998 年美國德克薩斯大學Sakurai 等在探索控制進食新藥的試驗中,在大鼠下丘腦腹外側核內發現2種與食欲有關的神經肽，分別為食欲素A（Orexin A，OXA ）和食欲素B（Orexin B，OXB）[1]，亦稱為食欲肽和增食欲素。Orexin的主要作用表現在刺激動物采食、能量代謝、內分泌調節和睡眠-覺醒循環等方面，近年來，有研究表明Orexin除上述生理功能外，對下丘腦-垂體-性腺軸（HPG）可能具有一定的調節作用，但具體機制不詳。故本研究對OX1R，OX2R和AMHR2受體在下丘腦-垂體-睪丸中分布與細胞定位進行了研究，并就其對睪丸生精功能可能的調節機制進行了探討，現具體報道如下。

材料與方法

一、實驗動物與分組

正常清潔級雄性（SD）大鼠40只，其中性成熟組（75~90d）20只，性未成熟組（30d）20只，兩組體質量分別為230~450g和100~150g，由新疆醫科大學實驗動物中心提供。

二、主要儀器與試劑

切片機（Leica RM2245），一抗訂購于Abcom公司多克隆抗體（兔抗OX1R ab68718、兔抗OX2R ab104701、鼠抗Anti-AMHR2 antibody [MIG7] ab64762）；二抗等試劑訂購于MaixinBio公司（即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液、檸檬酸抗原修復液、DAB顯色液），其他基礎試劑購自于MaixinBio公司。

三、試驗方法

（一）實驗動物準備

將性成熟和未成熟兩組SD雄性大鼠各20只，適應性飼養1周，飼養環境溫度為（23±3）℃，濕度為（50+5）%，照明晝夜比12h : 12h ，自由進水進食。

（二）取材與包埋

1周后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.5mL/100g體質量）麻醉下實施心臟4%多聚甲醛固定，并取出腦、垂體和睪丸組織，進行固定與石蠟包埋。

（三）觀察指標與方法

腦、垂體與睪丸用石蠟切片機連續切片，切片厚度腦為10μm，垂體與睪丸為4μm。行HE常規染色，MaxVision免疫組織化學法檢測OX1R，OX2R和AMHR2等指標，光鏡下觀察并攝片，其中棕黃色為陽性染色。

結 果

一、各組大鼠下丘腦、垂體和睪丸HE切片觀察結果

通過石蠟包埋組織切片HE染色，觀察發現性未成熟和性成熟大鼠下丘腦室周帶，穹窿內側為內側帶，穹窿外側是外側帶均有神經元分布，兩組腺垂體內分布有嗜酸性、嗜堿性及嫌色細胞，但是性未成熟組睪丸里有間質細胞、生精小管里僅有支持細胞和精原細胞，性成熟組睪丸里有間質細胞、生精小管里除有支持細胞外，還有精原細胞、初級精母細胞、精子細胞、精子等，見圖1、圖2。

圖1 性未成熟SD大鼠下丘腦、腺垂體、睪丸正常組織H-E染色

圖2 性成熟SD大鼠下丘腦、腺垂體、睪丸正常組織H-E染色

二、各組大鼠免疫組織化學檢測結果

用MaxVision法在下丘腦、腦垂體和睪丸檢測了OX1R，OX2R和AMHR2；光鏡觀察結果發現OX1R, OX2R和AMHR2等3個受體在兩組大鼠下丘腦、腺垂體、睪丸中陽性表達的細胞、細胞質及細胞膜呈棕黃色，這3種受體兩組中表達主要不同之處是在性成熟組睪丸間質細胞和精原細胞均表達陽性，而在性未成熟組僅僅在睪丸間質細胞陽性表達（圖3至圖8）。

1. 性未成熟SD大鼠下丘腦、垂體、睪丸中OX1R，OX2R和AMHR2的表達（圖3至圖5）。

2. 性成熟SD大鼠下丘腦、垂體、睪丸中OX1R，OX2R和AMHR2的表達（圖6至圖8）。

圖3 性未成熟大鼠下丘腦中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

圖4 性未成熟大鼠垂體中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

圖5 性未成熟大鼠睪丸組織中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

圖6 性成熟大鼠下丘腦中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

圖7 性成熟大鼠垂體中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

圖8 性成熟大鼠睪丸組織中OX1R, OX2R, AMHR2的表達

討 論

OXA 和OXB來源于同一前體，人類 Orexins 前體（PPO）基因有1432個堿基對，有2個外顯子和1個內含子[2]。人類PPO基因位于染色體17q21 位點，其氨基酸序列與大鼠的有83%的同源性，大鼠和小鼠則有95%的同源性[1]。已分離出的OXA為含有33個氨基酸的神經肽，N端是焦谷氨酰殘基，C端酰氨化，4個半胱氨酸殘基形成兩套鏈內的雙硫鍵。OXB為含有28個氨基酸的小肽，其中46 %（13/28）的氨基酸與OXA一致。人和小鼠、大鼠、豬、牛的OXA氨基酸序列完全相同，而人類OXB序列中僅有兩個氨基酸不同于嚙齒類，這提示了Orexins在生物進化中的保守性[1]。

Orexins的受體分為OX1R、OX2R兩型，其基因定位于OX1R-1p33；OX2R-6cen（p11-Q11）。OX1R、OX2R均為具有7個跨膜結構區的G蛋白耦聯受體，均可被OXA、OXB所激活，其中OX2R與OXA、OXB兩種食欲素具有較強的親合力，屬OXA、OXB 的非選擇性受體，但OX1R則具有選擇性，其與OXA的親合力較OXB大100~1000倍[1]。其他相關研究顯示[3]，OX1R與OX2R的氨基酸序列同源性達64%明顯高于其他G蛋白耦聯受體，人類的OX1R、OX2R與大鼠的一致性分別達到94%和95%。提示OX1R 、OX2R與Orexins，在種系發育中具有高度保守性。

下丘腦75%~85%的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin -Releasing Hormone，GnRH）神經元與Orexin神經元纖維接觸，OX可能直接作用于腦垂體性腺激素的釋放和OXR的表達；提示OX參與垂體調控性腺功能的過程[6]。進一步的深入研究表明，OX1R、OX2R在GnRH神經元有，其中OX1R與Orexin神經纖維末端亦發生接觸[4]，且OXA能直接通過OX1R刺激GnRH神經元GnRH轉錄并釋放神經肽，提示OXA對GnRH的轉錄并釋放相關激素的調控作用可能發生于GnRH神經元水平上[5]。

免疫組化方法研究顯示人睪丸組織中，間質細胞、支持細胞OX1R和OX2R陽性[7]。在羊駝睪丸間質細胞上OX1R陽性表達，體外培養睪丸組織檢測睪酮濃度發現，OXA可提高間質細胞睪酮分泌水平，同時，支持細胞亦可產生OXA和AMH[8]，而體外培養大鼠睪丸組織研究中發現OX1R抑制劑可阻止OXA提高睪酮水平的作用，并由此推測OXA通過拮抗AMH，競爭性的與OX1R結合，并通過激活該通路來調控哺乳動物睪丸睪酮的水平[9]。

抗中腎旁管激素（AMH）又稱中腎旁管抑制物（MIS），是轉化生長因子家族的成員，是男性性別分化的重要因子，相關研究表明[8]，OXA增加間質細胞睪酮分泌，AMH抑制間質細胞睪酮分泌，但OXA和MIS同時加在培養液里，AMH某種程度上抑制OXA增加睪酮作用，另外支持細胞產生OXA和AMH。研究離體培養性成熟的成年AMH缺陷鼠發現，間質細胞欠分化，從而導致雄激素水平質變，這有助于不育癥的發生[10]。

最近一些資料顯示，食欲素在下丘腦-腦垂體-睪丸軸不同層面對性腺有直接作用，食欲素在睪丸內通過自分泌/旁分泌方式調節睪丸功能；食欲素這些新作用即調控雄性生殖腺軸作用，提示食欲素直接連接能量平衡和生殖功能[11]。

OX1R、OX2R在下丘腦表達主要作用表現在刺激動物采食、能量代謝和內分泌調節等作用，食欲素兩類受體mRNA在大鼠腦內的分布不盡相同。OX1R的mRNA在丘腦服內側核含量較高，而OX2R的mRNA在丘腦室旁核、小腦皮質、斜方體核、頂蓋前核前端等處含量較高[12]。用免疫組化方法可觀察到OX1R、OX2R在大鼠下丘腦、丘腦、中腦和網狀結構的多種核團內出現，尤其在下丘腦、丘腦等處[13,14]。本實驗性未成熟、性成熟組SD雄鼠OX1R、OX2R在下丘腦外側帶神經元細胞質及細胞膜表達陽性并含量較高。兩組SD雄鼠OX1R、OX2R在腺垂體少數細胞細胞質陽性， Blanco等研究人垂體OXR發現，OX1R分布于腺垂體嗜酸性細胞內，其同時表達OX1R和GH。OX2R分布于垂體中間部和垂體前葉的嗜堿性細胞中，同時表達OX2R和ACTH[15]。但是本實驗所使用的MaxVision染色法沒有能夠區分嗜酸性和嗜堿性細胞。兩組SD雄鼠OX1R、OX2R在睪丸的表達卻不同，性未成熟組OX1R、OX2R在睪丸只有間質細胞細胞膜及細胞質表達陽性；而性成熟組OX1R、OX2R在睪丸間質細胞及精原細胞細胞膜、細胞質均表達陽性，這與Karteris等[7,8]結果顯示的睪丸組織中間質細胞、支持細胞OX1R和OX2R陽性有所不同，本實驗性成熟組睪丸組織里除間質細胞OX1R、OX2R均陽性表達之外，精原細胞也表達陽性。

AMH有兩個受體，分別為AMHR1和AMHR2[16]。AMH通過AMHR2調節間質細胞分化[17]，出生后，AMH抑制未成熟大鼠的間質細胞增殖和分化，且抑制成年大鼠間質細 胞睪酮分泌[18]。AMHR2在未分化間質細胞表達，支持了出生后AMH直接調節大鼠睪丸的發育假說[19]。

據文獻[20]腦組織里含有AMH、AMHR2，本實驗兩組AMHR2在下丘腦外側帶神經元細胞質及細胞膜陽性表達比較高，兩組AMHR2在腺垂體少數細胞細胞質表達陽性，尚未見報道。兩組SD雄鼠AMHR2在睪丸的表達卻不同，性未成熟組AMHR2在睪丸只有間質細胞細胞膜及細胞質表達陽性；而性成熟組AMHR2在睪丸間質細胞及精原細胞均表達陽性，這兩組中間質細胞均陽性表達，此結果中兩組間質細胞均陽性表達，與性未成熟、性成熟大鼠睪丸間質細胞AMHR2的陽性表達報道相似[21]，性未成熟組與Wu等[17,19]結果顯示 的AMHR2在未分化間質細胞表達并AMH通過AMHR2調節間質細胞分化相似，性成熟組與Ohyama實驗結果相似；Ohyama等研究發現性成熟大鼠睪丸里AMH 、AMHRⅡ在精母細胞表達陽性[22]。

結論：兩組SD雄鼠OX1R、OX2R、AMHR2等3種受體確實分別分布于下丘腦、腦垂體和睪丸中，其中最明顯特點是3種受體在性未成熟組睪丸精原細胞呈現陰性，而在性成熟組精原細胞表達陽性，故我們推測3種受體參與下丘腦-腦垂體-睪丸性腺軸調節精原細胞分化。

1 Sakurai T, Amamiya A, Ishii M, et al. Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuroptides and G protein coupled receptors that regulate feeding behavior. Cell 1998; 92(4): 573-585

2 Sakurai T, Moriguchi T, Furuya K, et al. Structure and function of human prepro-orexin gene. J Bio Chem 1991; 274(25): 17771-17776

3 Baringa M. New appetite-boosting peptides found. Science 1998; 279(5354): 1134

4 Campbell RE, Grove KL, Smith MS. Gonadotropinreleasing hormone neurons coexpress orexin 1 receptor immunoreactivity and receive direct contacts by orexin fbers. Endocrinology 144(4): 1542-1548

5 Sasson R, Dearth RK, White RS, et al. Orexin A Induces GnRH Expression and Secretion from GT1-7 Hypothalamic GnRH Neurons. Neuroendocrinology 2006; 84(6): 353-363

6 Cataldi NI, Lux Lantos VA, Libertun C. Orexin A and B in vitro modify orexins receptors expression and Gonadotropins secretion of anterior pituitary cells of proestrous rats. Regul Pept 2014; 188(6): 25-30

7 Karteris E, Chen J, Randeva HS. Expression of human prepro-orexin and signaling characteristics of orexin receptors in the male reproductive system. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89(4): 1957-1962

8 Liguori G, Assisi L, Squillacioti C, et al. Presence, distribution and steroidogenic effect of the peptides orexin A and receptor 1 for orexins in the testis of the South American camelid Alpaca(Vicugna pacos). Gen Comp Endocrinol 2012; 179(1): 137-142

9 Assisi L, Tafuri S, Liguori G, et al. Expression and role of receptor 1 for orexins in seminiferous tubules of rat testis. Cell Tissue Res 2012; 348(2): 601-607

10 Wu X, Arumugam R, Baker SP, et al. Pubertal and adult leydig cell function in mullerian inhibiting substancedifcient mice. Endocrinology 2005; 146(2): 589-595

11 Nurmio M, Tena-Sempere M, Toppari J. Orexins and the regulation of the hypothalamic-pituitary-testicular axis. Acta Physiol(Oxf) 2010; 198(3): 349-354

12 Trivedi P, Yu H, MacNeil DJ. Distribution of orexin receptor mRNA in the rat brain. FEBS Lett 1998; 438(1-2): 71-75

13 Cluderay JE, Harrison DC, Hervieu GJ. Protein distribution of orexin-2 receptor in the rat central nervoussystem. Regul Pept 2002; 104(1-3): 131-144.

14 Hervieu GJ, Cluderay JE, Harrison DC. Gene expression and protein distribution of distribution of the orexin-1 receptor in the rat brain and spinal cord. Neuroscience 2001; 103(3): 777-797

15 Blanco M, Lopez M, Garcla-Caballero T, et al. Cellular localization of orexin receptors in human pituitary. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86(7): 1616-1619

16 Josso N, di Clemente N, Gouédard L. Anti-Müllerian hormone and its receptors. Mol Cell Endocrinol 2001; 179(1-2): 25-32

17 Wu X, Zhang N, Lee MM. Müllerian inhibiting substance recruits ALK3 to regulate leydig cell differentiation. Endocrinology 2012; 153(10): 4929-4937

18 Sriraman V, Niu E, Matlas JR. Müllerian inhibiting substance inhibits testosterone synthesis in adult rats. J Androl 2001; 22(5): 750-758

19 Lee MM, Seah CC, Masiakos PT, et al. Müllerianinhibiting substance type Ⅱ receptor expression and function in purifed rat leydig cells. Endocrinology 2014; 140(6): 2819-2827

20 Lebeurrier N, Launay S, Macrez R, et al. Anti-Mullerianhormone-dependent regulation of the brain serine-protease inhibitor neuroserpin. J Cell Sci 2008; 121(Pt20): 3357-3365

21 Mendis-Handagama SM, Di Clementi N, Ariyaratne HB, et al. Detection of anti-Mullerian hormone receptor II protein in the postnatal rat testis from birth to sexual maturity. Histol Histopathol 2006; 21(5): 125-130

22 Ohyama K, Ohta M, Hosaka YZ, et al. Expression of anti-Müllerian hormone and its type II receptor in germ cells of maturing rat testis. Endocr J 2015; 62(11): 997-1006

（2016-10-08收稿）

Study on the distribution of orexin and anti-mullerian hormone receptors in the hypothalamic-pituitary-testicular axis and their reproductive biological significance

Haimiti.Abudulimu1, Li Yan1, Guo Qiong1, Rong Xiaoling2, Li Tian1, Adilijiang.Yiming3*
1. Department of Histology and Embryology, Urumqi 830011, China;
2. Clinical Laboratory of the Second Affliated Hospital, Xinjiang Medical University;
3. Department of Anatomy, Xinjiang Medical University

Adilijiang.Yiming, E-mail: adljym@163.com

ObjectiveTo study the distribution of orexin receptor 1 (OX1R), orexin receptor2 (OX2R), antimullerian hormone receptor Ⅱ (AMHRⅡ) in hypothalamus, pituitary and testis of immature and mature male SD rats.MethodsImmunohistochemical stain was applied to detect the expressions of OX1R, OX2R, and AMHRⅡReceptors in hypothalamus ,pituitary and testis of the both rats.ResultsOX1R, OX2R, and AMHRⅡ receptors positively expressed at the neuron cell membrane and cytoplasm of periventricular zone, medial zone and lateral zone of hypothalamus in the both rats; there was also some positive cells in adenohypophysis of the both; the distribution of three receptors was obviously differences in the testis ,there were positive expressions of three receptors at cytoplasm and cell membrane of leydig cells in testis of immature rats, but there were positive expression of three receptors at cytoplasm and cell membrane of leydig cells and also spermatogonium in testis of mature rats.ConclusionHigher expression of three receptors were found in the hypothalamus-Pituitary-Testistular axis of the rats, indicating that orexin and anti-mullerian hormones may be associated with spermatogonium differentiation of male reproductive system.

orexin receptor; anti-mullerian hormone receptor; Rats, Sprague-Dawley; leydig cells; Spermatogonia

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.11.001

R 321.1

*通訊作者，E-mail: adljym@163.com