趨化因子CXCL11在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的表達及其作用

張海峰 吳興 丁曉凌 強暉 曹維 陳海琴 周國雄

·論著·

趨化因子CXCL11在急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織的表達及其作用

張海峰 吳興 丁曉凌 強暉 曹維 陳海琴 周國雄

目的觀察趨化因子CXCL11在急性壞死性胰腺炎(ANP)病程中的動態變化，探討其在ANP發病過程中的作用。方法48只SD大鼠按數字表法隨機分為對照組和ANP組，每組24只。采用4%牛黃膽酸鈉(1 ml/kg體重)逆行胰膽管注射方法制備ANP大鼠模型。術后1、3、6、12 h處死大鼠，留取標本。檢測血清淀粉酶活性，胰腺組織行常規病理檢查并評分，免疫組化法檢測胰腺組織CXCL11表達，定量PCR法檢測胰腺組織CXCL11 mRNA 表達，酶聯免疫吸附試驗法檢測血清CXCL11水平。結果ANP組大鼠血清淀粉酶活性較對照組顯著升高[6 h時為(6153±355)U/L比(185±32)U/L，P<0.05]；胰腺病理損傷明顯，病理評分較對照組顯著增加[6 h時為(9.00±0.63)分比(0.33±0.12)分，P<0.05]；胰腺組織CXCL11 mRNA及蛋白表達較對照組顯著增強(6 h時為3.13±0.43比0.99±0.24，2.76±0.27比0.33±0.12，P值均<0.05)；血清CXCL11水平較對照組明顯升高[6 h時為(112.1±14.2)ng/L比(56.8±4.3)ng/L，P<0.05]。結論CXCL11是急性胰腺炎早期的炎癥介質，參與了大鼠ANP的發病過程。

胰腺炎，急性壞死性； 趨化因子類； CXCL11

趨化因子CXCL11又稱I-TAC,全稱為干擾素誘導T細胞α趨化因子，由神經膠質細胞、支氣管內皮細胞、血管內皮細胞等細胞分泌。其受體CXCR3主要在Th1細胞表達，在炎癥局部發揮誘導炎性細胞聚集的作用。有研究表明，在慢性胰腺炎中CXCL11及CXCR3表達明顯增加，但在重癥急性胰腺炎中CXCL11是否參與尚不清楚。本實驗檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺及血清CXCL11的表達，探討其在ANP發病過程中的作用機制。

材料與方法

一、動物模型的建立及實驗分組

健康SD大鼠，清潔級，雌雄不限，體重(220±20)g，由南通大學實驗動物中心提供。按數字表法將大鼠隨機分成ANP組及對照組，每組24只。參照Lankisch等[1]方法，以0.1 ml/min的速度向膽胰管內注射4%牛磺膽酸鈉1ml/kg體重制備ANP模型。對照組僅翻動胰腺2次后關腹。術后1、3、6、12 h分批抽血處死大鼠。

二 、檢測指標與方法

1．淀粉酶測定：采用碘-淀粉比色法，由深圳邁瑞半自動生化分析儀測定，按照試劑盒說明書操作。

2．胰腺病理學檢查：胰腺組織經HE染色后，由兩位專業的病理醫師雙盲閱片。每組每個時間點取3張切片，每張切片選取10個高倍鏡視野，參考Rongione等的評分標準，從水腫、感染、出血和壞死4方面進行評分(表1)，取各項積分和為最終得分。

表1 胰腺組織病理評分標準

3．胰腺組織CXCL11蛋白檢測：采用常規免疫組織化學方法檢測。兔抗鼠CXCL11抗體購自上海勁馬生物公司，工作濃度1∶100。以公司提供的陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。用彩色病理圖像分析系統采集圖像。由兩位病理醫師雙盲閱片。細胞質、核膜或胞膜呈現棕黃色顆粒為陽性。每張切片隨機觀察10個不同視野，計數陽性細胞，計算其占總細胞的百分比。

4．CXCL11 mRNA檢測：采用定量PCR法。應用Trizol試劑(Invitrogen公司)提取胰腺組織總RNA，根據Genbank中基因序列自行設計引物，由上海生工生物工程有限公司合成。CXCL11引物序列為5′-GGCTGACAAAGTTGAAGTGA-3′和5′-CCA-AGACAGGAGAGGGTCAG-3′，產物191 bp；內參GAPDH引物序列為5′-AAGGTGGTGAAGCAGGCGGC-3′和5′-GAGCAATGCCAGCCCCAGCA-3′，產物130 bp。PCR反應參數：95℃ 15 min，95℃ 15 s、57℃ 30 s、72℃ 40 s，40次循環，72℃ 5 min。PCR產物經凝膠電泳分離后用圖像掃描儀測定光吸收值，以目的條帶與GAPDH條帶的光吸收值比為mRNA相對表達量。

5．血清CXCL11水平檢測：采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測，試劑盒購自上海勁馬生物公司，嚴格按說明書操作。

三、統計學處理

結 果

一、血淀粉酶變化

術后1、3、6、12 h對照組大鼠血淀粉酶活性分別為(182±65)、(228±57)、(185±32)、(173±51)U/L，ANP組分別為(2914±503)、(3307±745)、(6153±355)、(7695±105)U/L，ANP組顯著高于同時間點對照組(P值均<0.05)。

二、胰腺組織學改變及病理評分

對照組大鼠肉眼見胰腺、胰周脂肪組織、網膜均無異常，無腹水；鏡下見細胞結構清楚，小葉結構明確，間質無水腫，無壞死、出血。ANP組6 h后肉眼可見大量血性腹水，胰腺水腫、出血、壞死，胰周及網膜可見皂化斑，與周圍組織粘連；術后1、3 h鏡下見小葉間質水腫，點狀出血，炎性細胞浸潤，部分腺泡細胞變性壞死，6、12 h見大量炎性細胞浸潤，片狀出血，小葉結構破壞，腺泡細胞大量壞死(圖1)。術后1、3、6、12 h對照組胰腺的病理評分分別為(0.26±0.08)、(0.27±0.09)、(0.33±0.12)、(0.50±0.15)分，ANP組為(5.17±0.75)、(6.67±0.52)、(9.00±0.63)、(11.33±0.84)分，ANP組顯著高于同時間點對照組(P值均<0.05)。

圖1對照組(a)、ANP組(b)大鼠胰腺組織病理改變(HE ×200)

三、胰腺組織CXCL11蛋白表達

對照組大鼠胰腺腺泡細胞弱表達CXCL11蛋白，術后1、3、6、12 h的表達量分別為0.32±0.08、0.27±0.09、0.33±0.12、0.40±0.15，無顯著變化；ANP組大鼠胰腺腺泡細胞CXCL11蛋白表達量明顯增加(圖2)，術后1、3、6、12 h的表達量分別為1.28±0.18、1.88±0.22、2.76±0.27、3.89±0.32，隨時間延長而增加，且均顯著高于同時間點對照組(P值均<0.05)。

圖2對照組(a)、ANP組(b)大鼠胰腺組織CXCL11蛋白表達(免疫組化 ×400)

四、胰腺組織CXCL11 mRNA表達

術后1、3、6、12 h對照組大鼠胰腺組織CXCL11 mRNA表達量分別為1.12±0.22、1.01±0.15、0.99±0.24、1.01±0.32，無明顯變化；ANP組大鼠表達量分別為1.31±0.22、2.10±0.34、3.13±0.43、2.81±0.37，隨時間延長而逐漸升高，且較同時間點對照組顯著增加(P值均<0.05，圖3)。

圖3胰腺組織CXCL11 mRNA的PCR擴增曲線(a)和熔解曲線(b)

五、血清CXCL11水平

術后1、3、6、12 h對照組大鼠血清CXCL11水平分別為(60.3±4.5)、(53.0±7.8)、(56.8±4.3)、(57.2±9.0)ng/L，ANP組分別為(82.2±11.3)、(94.0±9.9)、(112.1±14.2)、(102.5±13.1)ng/L，ANP組較同時間點對照組顯著升高(P值均<0.05)。

討 論

重癥急性胰腺炎(SAP)患者病死有二個高峰[2-4]。第一個是在病程第1周，由于胰酶的激活、胰腺的自身消化及胰酶釋放入血激活巨噬細胞等炎癥細胞釋放大量炎癥因子(包括各種細胞因子)，觸發炎癥介質瀑布樣級聯反應[5-7]，通過血液循環和淋巴管途徑，輸送到全身，引起全身炎癥反應綜合征，導致多臟器功能障礙，微循環衰竭而病死；第二個是在發病后2～6周，多由于感染和菌血癥、膿毒血癥引起。

越來越多的研究表明，CXC和CC類趨化因子在輕癥急性胰腺炎(MAP)向SAP演變及SAP的局部和全身并發癥中起了重要作用 。應用趨化因子阻斷劑可明顯降低SAP的嚴重程度，減少SAP并發癥，并提高療效[8-14]。Brady等[9]以雨蛙肽和牛磺膽酸鈉分別誘導大鼠水腫型和壞死型急性胰腺炎模型，結果顯示胰腺組織MCP-1 mRNA表達增強，并且其表達強度與胰腺炎的輕重程度呈正比。Bhatia等[8]報道，用BX471拮抗CCR1促中性粒細胞的歸巢，可減輕胰腺炎病情；拮抗CXCR2可減輕胰腺炎及其肺損傷程度。

CXCL11是非ELR類趨化因子，主要表達在正常個體胸腺、脾、肺、胰腺等器官的星形膠質細胞、支氣管內皮細胞、血管內皮細胞等[7]，在生理情況下表達量較少。有資料表明，CXCL11-CXCR3系統的細胞趨化作用是免疫炎癥反應的一個重要環節[15-16]，參與在炎癥、感染、腫瘤、應激、自身免疫、變態反應、移植排斥反應、AIDS、淋巴細胞歸巢以及新生血管形成等眾多病理生理的發生發展過程[17-18]。在炎癥、感染等條件下，IFN刺激血管內皮細胞等產生CXCL11，后者刺激活化的T細胞遷移，同時產生IFN等細胞因子，形成正反饋回路。

本研究結果顯示，對照組胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表達很弱，血清CXCL11水平很低。ANP組大鼠胰腺CXCL11 mRNA及蛋白表達明顯增強，且與胰腺的病理損傷呈正比，血清CXCL11水平也升高，證實CXCL11是急性胰腺炎早期的炎癥介質，檢測血清CXCL11水平的動態變化或許可以幫助判斷急性胰腺炎的病變程度。

[1] Lankisch PG,Ihse I.Bli-induced acute experimental pancreatitis.Scand J Gastroenterol,1987,22:257-260.

[2] Uhl W, Warshaw A, lmrie C, et al. IAP guidelines for the surgical management of acute pancreatitis．Pancreatology, 2002, 2: 565-573.

[3] Cappell MS. Acute pancreatitis: etiology, clinical presentation, diagnosis, and therapy. Med Clin North Am, 2008, 92: 889-923.

[4] Norman J. The role of cytokines in the pathogenesis of acute pancreatitis. Am J Surg, 1998, 175: 76-83.

[5] Bhatnagar A, Wig JD, Majumdar S. Immunological findings in acute and chronic pancreatitis. ANZ J Surg, 2003, 73: 59-64.

[6] Makhija R, Kingsnorth AN. Cytokine storm in acute pancreatitis. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2002, 9: 401-410.

[7] Frossard JL,Rubbia-Brant L,Walling MA,et al.Sever acute pancreatitis and reduced acinar cell apoptosis in the exocrine pancreas of mice deficient for Cx32 gene. Gastroenterology,2003,124: 481-493.

[8] Bhatia M,Hegde A.Treatment with antileukinate a CXCR2 chemokine receptor antagonist protects mice against acute pancreatitis and associated lun jury.Regul Pept,2007,138:40-48.

[9] Brady M,Bhatia M,Christmas S,et al.Expression of the chemokines MCP-1/JE and cytokine-induced neutrophil chemoattractant in early acute pancreatitis. Pancreas,2002,25:260-269.

[10] 周國雄，周德霞，丁曉凌，等.趨化因子CCL20及其受體CCR6在急性壞死性胰腺炎中的表達及意義.中華胰腺病雜志,2010,10:263-266.

[11] Rau B, Baumgart K, kruger CM, et al.CC-chemokine activation in acute pancreatitis:enhance release of monocyte chemoattractant protein-1 in patients with local and systemic complications. Intensive Care Med, 2003, 29: 622-629.

[12] Bhatia M,Brady M,Zagorski J,et al.Treatment with neutralising antibody against cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC) protects rats against acute pancreatitis associated lung injury.Gut,2000,47:838-844.

[13] Zhou GX，Zhu XJ，Ding XL．et al．Protective effects of MCP-1 inhibitor on a rat medel of severe acute pancroatitis．Hepatobiliary Pancreat Dis Int，2010,9：201-207.

[14] Osma MO,Krestensen JU,Jacobsen NO,et al.A monoclonal anti-interleukin 8 antibody(WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotising pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43:232-239.

[15] 祝先進，蘇東輝. 一種新的趨化因子. 國際免疫學雜志, 2006, 6: 330-334.

[16] Muller M, Carter S,Hofter MJ.Review:The chemokine receptor CXCR3 and its ligand CXCL9,CXCl10 and CXCL11 in neuroimmunity-a tale of conflict and conundrum.Neuropathol Appl Neurobiol,2010,36:368-387.

[17] Petrai I, Rombouts K, Lasagni L,et al. Activation of p38(MAPK) mediates the angio2-static effect of the chemokine receptor CXCR3-B. Int J Biochem Cell Biol, 2008, 40: 1764-1774.

[18] 陳歡, 張桂英. 趨化因子受體CXCR3的研究進展.實用預防醫學, 2010,15: 1466-1468.

ExpressionandroleofchemokineCXCL11inpancreasofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHANGHai-feng,WUXing,DINGXiao-ling,QIANGHui,CAOWei,CHENHai-qin,ZHOUGuo-xiong.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong226001,China

ZHOUGuo-xiong,Email：zhouguoxiong@medmail．corn．cn

ObjectiveTo investigate the dynamic expressions of CXCL11 and its role in the pathogenesis of acute necrotizing pancreatitis (ANP).MethodsForty-eight SD rats were randomly divided into control group and ANP group, with 24 rats in each group. ANP model was induced by retrograde injection of 4% sodium taurocholate (1 ml/kg body weight) into the biliary and pancreatic duct. The rats were sacrificed at 1, 3, 6, 12 hours. Serum level of amylase was determined, pathological changes in pancreatic tissue were routinely observed and scored. The expression of CXCL11 mRNA and proteon in pancreas was measured by fluorescence quantitative polymerase chain reaction and immunohistochemical method. The serum levels of CXCL11 were measured by enzyme-linked immunoadsorbent assay.ResultsThe serum levels of amylase in ANP rats were significantly higher than those in control group [(6153±355)U/Lvs(185±32)U/L at 6 h,P<0.05], pathological changes in pancreatre tisues were more significant in ANP rats, and the pathological score was significantly higher than that in control group [(9.00±0.63)vs(0.33±0.12) points at 6 h,P<0.05]; the expressions of CXCL11 mRNA and protein in pancreatic tissue were significantly increased than those in control group (3.13±0.43vs0.99±0.24, 2.76±0.27vs0.33±0.12 at 6 h,P<0.05). The serum level of CXCL11 was significantly higher than that in control group [(112.1±14.2)ng/Lvs(56.8±4.3)ng/L at 6 h,P<0.05)].ConclusionsCXCL11 is an early inflammatory mediator in acute pancreatitis, and involved in the pathogenesis of ANP in rats.

Pancreatitis, acute ncerotizing； Chemokines, CXC; CXCL11

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.06.009

南通市社會發展基金(S5054)

226001 江蘇南通，南通大學附屬醫院消化科(張海峰、丁曉凌、強暉、曹維、陳海琴、周國雄)；江蘇省泗洪縣人民醫院消化科(吳興)

周國雄，Email: zhouguoxiong@medmail.com.cn

2012-04-28)

(本文編輯：呂芳萍)