FOXC1蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

喬　麗　劉　杰　高　薇　林文俐　孫玉萍

(濰坊醫學院研究生院，山東　濰坊　261053)

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FOXC1蛋白在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

喬麗劉杰1高薇2林文俐1孫玉萍1

(濰坊醫學院研究生院，山東濰坊261053)

〔摘要〕目的探討非小細胞肺癌(NSCLC)中FOXC1蛋白的表達與臨床病理參數的相關性。方法采用免疫組織化學MaxVisionTM一步法檢測86例NSCLC組織及20例肺良性病變組織中FOXC1蛋白的表達情況，并分析其與臨床病理參數之間的相關性。結果FOXC1蛋白表達定位于NSCLC癌細胞的胞質及胞核內；其在NSCLC組織及肺良性病變組織中的高表達率分別為62.79%(54/86)和25%(5/20)，差異有統計學意義(P=0.002)；其表達與淋巴結轉移、TNM分期密切相關，FOXC1蛋白在有淋巴結轉移的NSCLC組中的高表達率為81.25%(39/48)，在無淋巴結轉移組中高表達率為39.47%(15/38)，差異有統計學意義(P=0.000)；Ⅲ期NSCLC組中高表達率為77.8%(28/38)，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組中高表達率(52%，26/50)(P=0.015)；而與分化程度、組織學類型、腫瘤大小、性別、年齡、吸煙等均無明顯相關性(P均>0.05)。結論FOXC1蛋白可能在肺癌的侵襲、轉移過程中發揮重要的作用，可能為抑制NSCLC的侵襲轉移提供新的治療靶點和方向。

〔關鍵詞〕FOXC1；非小細胞肺癌；免疫組織化學

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺惡性腫瘤的80%～85%〔1〕。盡管手術、化療、放療及分子靶向治療在肺癌的治療中取得了長足的進步，但肺癌患者的5年生存率僅為15%，導致上述現象的主要原因是腫瘤的復發和轉移。FOXC1蛋白是叉頭框轉錄因子基因家族(FOX家族)的一員，可調節一系列的生物學過程。對FOXC1的早期研究主要集中在其對胚胎發育的影響，發現其參與了眼睛、腎臟及肢體等重要器官的發育。近幾年研究發現其在腫瘤的發生發展中也發揮重要作用。Du等〔2〕報道FOXC1能抑制乳腺癌細胞的惡性轉移和侵襲能力，然而，另有研究〔3～5〕結果提示高表達的FOXC1不僅可獨立誘導上皮-間質轉化(EMT)，還可通過下調E-鈣黏附蛋白的表達促進EMT的發生，進而促進乳腺癌及子宮內膜癌細胞的侵襲及轉移。目前，FOXC1蛋白在NSCLC中的表達及臨床意義的研究國內尚無報道。本研究旨在應用免疫組化的方法，檢測FOXC1蛋白在NSCLC中的表達情況并探討其與臨床病理參數的相關性，分析其在NSCLC發生發展過程中的作用。

1材料與方法

1.1標本組織來源收集2008～2011年山東大學附屬醫院濟南市中心醫院病理科86例NSCLC患者石蠟包埋組織，臨床資料記錄詳細?；颊呔鶠槌踉\，在我院行手術治療，術前均未進行放化療及其他治療，術后標本經病理證實均為NSCLC。同時選取20例肺良性病變組織作為對照，術后經病理證實均未見癌細胞。86例NSCLC患者中，男63例，女23例；年齡35～81歲，中位年齡61歲；其中腺癌48例，鱗癌38例；TNM分期按UICC2010年修訂標準:Ⅰ～Ⅱ期50例，Ⅲ期36例，依據病理分化程度類型分為:高-中分化癌41例，低分化癌45例，有淋巴結轉移的48例，無淋巴結轉移的38例。本實驗經醫院倫理委員會批準，并遵循患者知情同意的原則。

1．2主要試劑FOXC1羊抗人多克隆抗體購自美國SANTA CRUZ公司(工作濃度1∶200)，MaxVisionTM超敏試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司。

1．3檢測方法采用免疫組織化學MaxVisionTM一步法進行石蠟腫瘤組織中抗原檢測。所有腫瘤組織標本均經10%甲醛固定，石蠟包埋，連續3～4 μm切片。切片烤片后常規脫蠟水化。FOXC1抗原在EDTA中高壓修復2 min，流水冷卻至室溫，PBS沖洗3次，每次3 min；采用0.3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，每張切片滴加一抗50 μl，4℃孵育過夜，室溫復溫30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；除去PBS液，每張切片滴加1滴即用型MaxVisionTM試劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。每次試驗用已知陽性正常肺組織作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1．4結果判斷由具有正高職稱病理科醫師雙盲閱片，每張切片高倍鏡下隨機選取10個視野，陽性細胞比率和染色強度分值綜合評定。陽性細胞比率判定：0%為0分，1%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分；染色強度：未著色為0，淺黃色為1分，黃色2分，棕黃色為3分；兩者分數相乘≤3為低表達，>3為高表達。

1．5統計學處理采用SPSS18.0統計軟件行χ2檢驗。

2結果

2.1FOXC1蛋白在NSCLC、肺良性病變組織中的表達FOXC1蛋白表達定位在胞核和胞質，呈淺黃色、黃色或棕黃色顆粒(圖1)。FOXC1在肺腺癌、鱗癌中的胞質及胞核中高表達，FOXC1在肺腺癌、鱗癌中胞質中的高表達，FOXC1在肺腺癌、鱗癌中的陰性表達FOXC1沒有單獨核表達現象，多數以單獨胞質表達形式存在，也存在核、質同時表達。FOXC1在86例NSCLC中單獨質高表達的例數為41例(47.67%)。NSCLS組與肺良性疾病變組間FOXC1蛋白高表達率分別為62.79%和25.0%，兩組差異有統計學意義(P=0.002)。見圖1。

圖1　FOXC1在肺癌細胞中的表達(DAB，×200)

2.2NSCLC中FOXC1蛋白的表達及其與臨床病理學參數的關系FOXC1蛋白在有淋巴結轉移的NSCLC組中的高表達率顯著高于無淋巴結轉移組中高表達率(P=0.000)；Ⅲ期中高表達率，明顯高于Ⅰ～Ⅱ期組中高表達率(P=0.015)。而FOXC1蛋白在NSCLC中的高表達率與其分化程度、組織學類型、腫瘤大小、性別、年齡及有無吸煙史等病理學特征無明顯相關性(P均>0.05)，見表1。

表1　FOXC1在NSCLC組織中的表達及與

與相對臨床病理特征比較：1)P=0.000；2)P=0.015

3討論

轉錄因子FOXC1是叉頭框(FOX)轉錄基因家族(FOX家族)中的一員，與家族其他成員一樣，它具有高度保守的DNA結合區及轉錄調節區，由100個氨基酸殘基組成的保守DNA結合區域，呈螺旋狀結構，位于染色體6p25，全長3 500 bp，僅包含一個長約1 600 bp的外顯子，編碼的蛋白質含553個氨基酸殘基。FOXC1蛋白從N端到C端的結構依次為轉錄激活區(AD1)，DNA結合叉頭區(FHD)，抑制區/磷酸化區和轉錄激活區(AD2)，叉頭區的兩端均有1個核定位信號(NLS)〔6〕。FOXC1在組織的生長發育過程中發揮重要作用，小鼠體內FOXC1基因敲除后會導致心臟及血管流出道、腎臟、骨骼等多種組織和器官發育障礙〔7～9〕。近年研究發現，其在腫瘤的發生發展中也發揮重要作用。FOXC1在胰腺癌中存在高表達，并且與分化程度、TNM分期及淋巴結轉移有關〔10〕；另外，FOXC1在喉癌、肝細胞肝癌中都存在表達上調現象，與疾病進展有關〔11，12〕，由此推測，FOXC1可能參與腫瘤的侵襲和轉移過程。然而，FOXC1在NSCLC中的作用研究甚少。

本研究顯示，FOXC1在NSCLC組織中的表達顯著高于肺良性病變組織，定位在胞核和胞質，胞質單獨表達的現象較高，所占比例為47.67%(41/86)。有研究證實FOXC1是一種核定位的磷酸蛋白，其通過叉頭區兩端的核定位信號(NLS)這一DNA結構域結合目的基因片段，定位于胞核內并參與轉錄過程〔6〕。但Taube等〔13〕研究發現FOXC1有質表達現象，且質表達與核表達同時出現，這與本研究結果一致。與FOXC1同一家族的另一成員FOXO1，未磷酸化時定位在胞核，當受到上游因子AKt作用后發生磷酸化，從胞核轉移到胞質內。因此FOXC1在胞質中高表達可能與其磷酸化有關，具體機制有待進一步研究。

已有研究證實，FOXC1在胰腺癌、喉癌、肝細胞肝癌中也存在表達上調現象，與疾病進展有關〔10～12〕。推測FOXC1可能促進了NSCLC的淋巴結轉移和侵襲過程。

FOXC1促進淋巴結轉移的分子機制尚不明確，但近年研究報道，EMT可能是腫瘤侵襲轉移的重要機制。在乳腺癌的研究中發現，FOXC1通過促進EMT的發生從而促進癌細胞的侵襲及遷移〔13〕。癌細胞在EMT的過程中因喪失極性而獲得活動能力，可在細胞基質間游走，形成局部擴散，進而侵入淋巴管及血管，進而發生轉移。Seo等〔14〕在胚胎發育研究中發現，FOXC家族轉錄調節因子通過上調Dll4、Notch1、Notch4、Hey2及VEGF-C等的表達進而促進血管和淋巴管的形成。推測FOXC1通過促進EMT的發生及淋巴管的形成，進而促進NSCLC的侵襲和淋巴結轉移，但具體作用機制有待進一步研究。

綜上，FOXC1蛋白在NSCLC的胞核或胞質中存在高表達，并與淋巴結轉移及臨床分期密切相關。因此，明確FOXC1在NSCLC發生發展過程中的作用，可以為抑制NSCLC的侵襲轉移提供新的治療靶點和方向。

4參考文獻

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〔2014-06-17修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：濟南青年科技明星計劃資助課題(No.20110321)

通訊作者：劉杰(1981-)，女，主治醫師，博士，主要從事腫瘤內科及腫瘤血管生成研究。

〔中圖分類號〕R734.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2171-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.056

1山東大學附屬濟南市中心醫院腫瘤科

2山東大學附屬濟南市中心醫院病理科

第一作者：喬麗(1984-)，女，在讀碩士，主要從事腫瘤免疫研究。