MT01對人成骨樣細胞系MG63內Toll樣受體7,9表達的影響

孫　晗　侯　旭　申玉芹　鄭　義　婁譯心　汪　洋　齊　佳　孫新華

(吉林大學口腔醫學院，吉林　長春　130021)

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MT01對人成骨樣細胞系MG63內Toll樣受體7,9表達的影響

孫晗侯旭申玉芹鄭義婁譯心汪洋齊佳孫新華

(吉林大學口腔醫學院，吉林長春130021)

〔摘要〕目的探討人成骨樣細胞系MG63(簡稱MG63)內Toll樣受體(TLRs)的表達情況及MT01與細胞內TLRs的關聯。方法應用RT-PCR法檢測MG63內TLR1～10 mRNA的表達情況；MT01與MG63作用12、24、48 h后,Real time PCR法檢測MG63細胞內TLR7,9 mRNA表達的變化；Western印跡法檢測MG63細胞內TLR7,9 蛋白表達的變化。結果MG63細胞表達TLR1～10 mRNA；一定濃度的MT01作用于細胞后,對TLR7,9 mRNA及蛋白表達有顯著的抑制作用，這種抑制作用無時間依賴性。結論MG63細胞表達TLR1-10 mRNA，一定濃度的MT01可影響MG63細胞內TLR7,9 mRNA及蛋白的表達。

〔關鍵詞〕MT01；人成骨樣細胞系MG63；Toll樣受體

Toll樣受體(TLRs)是一種模式識別受體，在高等脊椎動物的固有免疫和適應性免疫中起著樞紐作用〔1〕。有研究表明，TLRs家族中諸如TLR9對牙槽骨改建具有調控作用，可調控骨改建過程中成骨細胞的成骨分化〔2〕。目前發現，在TLRs受體家族中，存在于內質網和溶酶體上的TLR7,9可識別引發早期固有免疫應答的核酸類分子如寡脫氧核糖核苷酸(ODN)等〔3～5〕。MT01是本課題組依據人線粒體DNA序列設計并人工合成的單鏈DNA，是一種免疫負性調節劑，可抑制免疫細胞如人外周血單核細胞內TLR7,9與激動劑結合產生的炎癥反應〔5〕。筆者前期研究發現MT01可促進成骨細胞增殖、活化,抑制實驗性大鼠牙周炎導致的牙槽骨吸收,促進骨形成〔6,7〕。本實驗擬研究一定濃度MT01對成骨細胞MG63內TLR7,9表達的影響，為進一步闡述MT01調控骨改建的免疫學機制奠定基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料與試劑超凈工作臺(TECH，中國)；恒溫離心機(beckman coulter,美國)； CO2恒溫細胞培養箱(SANYO，日本)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；100 mm培養皿、 6孔板、8聯管(COSTAR，美國)；人源性成骨樣細胞系 MG63 (ATCC,CRL-1427)，MT01(吉林大學基礎醫學院分子生物學教研室自主設計、大連TAKARA全硫代修飾合成)；HG-DMEM(Gibco，美國)；胎牛血清(PAA 公司，美國)；胰蛋白酶(Sigma 公司，美國)； TLR7,9一抗(博奧森，中國)；β-actin一抗(Abcam,美國)；過氧化物酶標記的第二抗體(Molecular Probes，美國)；RIPA裂解液 (鼎國昌盛，中國)； TLR7,9 mRNA引物合成(三博遠志，中國)；SYBR Premix Ex Taq(大連TAKARA,中國)；Primer Script RT reagent Kit(大連TAKARA,中國)；反轉錄(RT)-PCR引物序列：TLR1：正義：CAGTGTCTGGTACACGCATGGT，反義：TTTCAAAAACCGTGTCTGTTAAGAGA；TLR2：正義：GCCAAAGTCTTGATTGATTGG，反義：TTGAAGTTCTCCAGCTCCTG；TLR3：正義：CCTGGTTTGTTAATTGGATTAACGA，反義：TGAGGTGGAGTGTTGCAAAGG；TLR4：正義：GGTGGAAGTTGAACGAATGG，反義：CTGTCCTCCCACTCCAGGTA；TLR5：正義：CAGAAACCTGCCCAACCTTAG，反義：GATCCAAGCGAGTTAAAGCCTT；TLR6：正義：GTGAGTGGTGCCATTACGAA，反義：TTTGGGAAAGCAGAGTGGAG；TLR7：正義：TTACCTGGATGGAAACCAGCTAC，反義：TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCTAG；TLR8：正義：AGCGGATCTGTAAGAGCTCCATC，反義：CCGTGAATCATTTTCAGTCAAGAC；TLR9：正義：GCAGTCAATGGCTCCCAGTTC，反義：GCGGTAGCTCCGTGAATGAGTG；TLR10：正義：TTATGACAGCAGAGGGTGATGC，反義：CTGGAGTTGAAAAAGGAGGTTATAGG；GAPDH：正義：CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反義：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。實時熒光定量(Real time)PCR引物序列:TLR7:正義：GGAGGTATTCCCACGAACACC，正義：TGACCCCAGTGGAATAGGTACAC；TLR9：正義：GGACCTCTGGTACTGCTTCCA，正義：AAGCTCGTTGTACACCCAGTCT；GAPDH：反義CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC，反義：TGAGCGATGTGGCTCGGCT。

1.2實驗方法

1.2.1RT-PCR法檢測MG63內TLRs mRNA的表達情況 復蘇 MG63，含10%胎牛血清的HG-DMEM 完全培養液培養、傳代，3×105個/孔細胞濃度鋪6孔板，孵育24 h，收集細胞，Trizol法提取總RNA，TAKARA逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA。配制25 μl RT PCR反應體系：Buffer(10×)2.5 μl,10 mmol/L dNTPs 2 μl,cDNA 1 μl,PCR上游引物0.5 μl,PCR下游引物0.5 μl,TaqDNA 聚合酶1 μl (2U),dd H2O 17.5 μl。PCR 條件為 94℃,60 s;55℃,120 s;72℃,90 s;循環30次。PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳后,在GIS 1D 凝膠成像分析系統上掃描定量。

1.2.2Real time PCR法檢測MT01作用后不同時間點MG63內TLR7,9 mRNA的表達情況細胞培養、鋪板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培養基后，于共孵育12、24、48 h分別收集細胞，加入同體積磷酸鹽緩沖液(PBS)設為空白對照組。RNA 提取及逆轉錄同前。在8連管中配制25 μl Real time PCR 反應體系：SYBR Primer Ex TaqTM(2×)12.5 μl，PCR上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl,ROX reference DyeⅡ(50×) 0.5 μl，cDNA 2 μl,ddH2O 9 μl。反應條件：95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min，循環48次。

1.2.3Western印跡法檢測MT01作用后不同時間點MG63內TLR7,9 蛋白的表達情況細胞培養、鋪板同前，加入含有1 mg/L MT01的完全培養基后，于共孵育12、24、48 h分別收集細胞，加入同體積PBS設為空白對照組。按照試劑盒說明提取蛋白質并對其進行定量。之后分別將預染蛋白和樣品液上樣，電泳分離總蛋白。按Bio-Rad蛋白轉移說明書組裝濾紙凝膠纖維素夾層,60 V恒壓條件下,4℃轉移2 h。將轉移后的膜在5%脫脂奶粉溶液中室溫孵育2 h,以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉后的膜加入一抗，4℃孵育過夜。加入過氧化物酶標記的二抗以結合一抗,室溫孵育2 h。化學發光法檢測,膜與化學發光底物孵育,經X膠片曝光顯影。

1.3統計學方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結果

2.1MG63內TLRs mRNA表達情況成骨樣細胞MG63內有TLR1～10 mRNA的表達，其中TLR2,5,10 mRNA表達稍弱 (圖1)。

圖1　RT-PCR法檢測MG63內TLR1～10 mRNA的表達情況

2.2不同時間點MT01對TLR7,9 蛋白表達的影響12、24 h組，TLR7蛋白量與對照組相比顯著減少，而48 h組的TLR7蛋白量與12、24 h組相比稍有增高，但仍低于對照組。實驗組TLR9蛋白的表達量低于對照組(圖2)。

圖2　MT01作用于MG63后，不同時間點TLR7, TLR9蛋白的表達情況

2.3不同時間點MT01對TLR7,9 mRNA表達的影響Real time PCR檢測顯示：MT01能抑制細胞內TLR7,9 mRNA的表達。12、24 h組中的TLR7 mRNA的表達量(0.072、0.071)顯著減少，與對照組(設為1)比差異顯著(P<0.05)；48 h組中的TLR7 mRNA的表達量(0.124)與前兩組相比略微增高，但仍低于對照組(P<0.05)。12、24、48 h組中的TLR9 mRNA表達量(0.443、0.146、0.149)均低于對照組(設為1)(P<0.05)。但MT01對TLR7,9 mRNA的抑制作用沒有明顯的時間依賴性。

3討論

人成骨樣細胞系MG63具有與人成骨細胞相似的表型特征及分化特性〔8〕，因其具有易培養、價格便宜、取材方便等特性，近年來被廣泛用來研究成骨等方面的特性。關于不同來源的成骨細胞上TLRs的表達情況目前尚無定論。Yasuyuki等〔9〕研究發現人成骨細胞系SaOS-2表達TLR1,4,5,6,9 mRNA；有學者研究發現骨髓間充質干細胞上表達TLR1～10 mRNA〔10〕；而Takeshi等〔11〕對于MC3T3的研究發現老鼠的成骨細胞僅表達TLR2,4,3,6 mRNA。造成這種差異的原因可能由于細胞起源及細胞種類不同，所能表達的TLRs種類也各不相同〔12〕。本實驗結果說明TLRs的表達可能受細胞種類的影響。這也提示如果選用不同種屬的細胞進行實驗，還要注意種屬特異性的問題。

MT01(5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3')的序列富含胞嘧啶，Yang等〔5〕研究表明MT01可以識別免疫細胞內的TLRs，并且抑制由TLR7,9介導的炎癥反應，這種免疫負調節活性可能是序列依賴性的。通過Hou等〔13〕對MT01進入細胞的時相性觀察發現，隨著加藥時間的變化， MT01 進入細胞的量表現出一定的時間依從性規律，在12 h進入細胞的量達到了峰值。本實驗結果說明MT01能抑制TLR7蛋白的表達。同時間點檢測的蛋白量與基因量稍有差異可能是由于在轉錄后的翻譯過程中，影響翻譯的條件如原料、模板、能量和酶等發生變化引起的〔14〕。

有研究表明TLR7,9的激活可導致自身免疫性疾病〔15〕、類風濕關節炎〔16〕及各種自身免疫性疾病的發生。同時有研究表明表達于成骨細胞及破骨細胞上TLR9的激活，可以誘導產生各種炎性因子如白介素、腫瘤壞死因子等〔2〕。這些炎性因子協同作用可以抑制成骨細胞的成骨功能，促進破骨細胞活化，從而破壞骨改建的平衡，導致骨吸收〔17〕。本實驗所用的這種新型的寡核苷酸MT01可以抑制TLR7,9的表達，抑制早期祖細胞的TLRs活化，抑制骨含量減少，保持骨代謝與免疫系統的平衡。本實驗發現MT01作為一種免疫負性調節劑能夠影響成骨細胞TLR7,9的表達，進而可以影響骨改建進程，因此，MT01有可能成為潛在的骨吸收抑制劑。深入研究MT01與骨改建的關系，可為今后的臨床應用提供一定實驗基礎。

4參考文獻

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〔2016-03-16修回〕

(編輯曲莉)

基金項目：吉林省科技廳自然科學基金面上項目資助項目(20150101173JC);吉林大學白求恩醫學科研支持計劃(2012080632)

通訊作者：孫新華(1954-)，女，教授，主要從事牙齒移動生物學研究。

〔中圖分類號〕R783.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2071-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.010

第一作者：孫晗(1990-),女，在讀碩士，主要從事牙齒移動生物學研究。