雷沙吉蘭對乳胞素誘導帕金森病大鼠神經的保護作用及機制

鮑　波　朱少平　胡　利　冷　揚　蘇小華　柴星星

(廣東醫學院實驗動物學教研室，廣東　湛江　524023)

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雷沙吉蘭對乳胞素誘導帕金森病大鼠神經的保護作用及機制

鮑波1朱少平1胡利2冷揚1蘇小華柴星星

(廣東醫學院實驗動物學教研室，廣東湛江524023)

〔摘要〕目的觀察雷沙吉蘭對乳胞素誘導帕金森病(PD)大鼠神經的保護作用及機制。方法SD大鼠分為空白對照組、模型組、雷沙吉蘭預治療組和治療組，通過立體定向注射乳胞素至模型大鼠左側黑質部位誘導模型，進行行為學、組織病理學檢測，PCR檢測目的蛋白表達變化。結果模型大鼠在阿樸嗎啡的誘導下，向右旋轉；與空白對照組相比，其余各組大鼠腦組織切片中酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞數顯著減少，但預治療組和治療組中TH陽性細胞較多； PCR定量顯示Lamp2A與熱休克蛋白(HSP)70在治療組與空白組間存在差異(P<0.05)，而治療組間無差異。 結論雷沙吉蘭可以抵抗乳胞素所致的神經損害，改善動物行為學及組織病理學表現，具有神經保護作用， 其機制可能與促進Lamp2A及HSP 70表達，減少TH陽性細胞丟失相關。

〔關鍵詞〕帕金森?。蝗榘?；雷沙吉蘭；自噬

帕金森病(PD)是一種不可治愈的、伴隨多巴胺能神經元逐步變性而不斷演進的神經系統疾病〔1〕，常見的臨床表現有靜止性震顫、肌強直和運動障礙，目前常用藥物替代體內逐漸減少分泌的多巴胺，減緩PD的運動癥狀，但需要長期服藥，并逐漸加大藥物劑量，導致更多的副作用，因此需要改變替代策略，以減輕各種運動及精神癥狀〔2〕。在體內、體外及臨床實驗研究中發現〔3〕，雷沙吉蘭不僅能明顯改善PD癥狀，而且具有能延緩PD進程的作用，其保護神經元的作用受到濃度及代謝產物等因素影響，機制比較復雜〔4,5〕。蛋白酶體抑制劑乳胞素被用于構建PD大鼠模型〔6〕，可以較好地模擬PD病理改變〔7〕。本實驗將通過乳胞素腦立體定位注射法構建大鼠PD模型，并觀察雷沙吉蘭能否對抗乳胞素引起的多巴胺能神經元損傷，以探討其可能的作用機制。

1實驗材料

1.1動物SPF級健康成年SD大鼠48只，體重250～300 g，雌雄各半，來自廣東醫學院實驗動物中心〔SCXK(粵)2008-0008〕。乳胞素(L6785，Sigma公司)、阿樸嗎啡(A4393，Sigma公司)；雷沙吉蘭和水合氯醛為國產試劑；抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體(單抗，R&D公司)；抗α-synulein抗體(單抗，Cell Signaling 公司)；DAB試劑盒(中杉金橋)；反轉錄試劑盒(Fermentas公司)；PCR擴增試劑盒(Takara公司)。大鼠腦立體定位儀(ZH-藍星C型，淮北正華生物儀器設備有限公司)；凝膠成像儀(InGemus LHR型，Syngene公司)。

1.2實驗方法

1.2.1造模將SD大鼠標記后隨機分成4組：空白對照組、模型組、預治療組和治療組，各12只。按每只每公斤體重300～350 mg水合氯醛腹腔注射麻醉，利用腦立體定位儀在左側黑質部位注射含8 μg乳胞素的二甲基亞砜(DMSO)溶液2 μl?？瞻讓φ战MSD大鼠黑質內注射DMSO 2 μl。給予預治療組及治療組中每只大鼠腹腔注射雷沙吉蘭(使用DMSO溶解)，劑量為0.15 mg/kg，1次/d；分別在造模前1 d和造模后1 w〔8〕開始給藥?？瞻讓φ战M和模型組給予生理鹽水腹腔注射作為對照。

1.2.2行為學檢測觀察SD大鼠是否出現被毛雜亂、身體屈曲、活動遲緩、震顫、抓握等異常行為，同時采用阿樸嗎啡誘導旋轉實驗評價行為學改變〔9〕：每只SD大鼠給予頸部皮下注射阿樸嗎啡0.5 mg/kg，3 min后，開始計時并記錄30 min內大鼠旋轉的圈數，以每分鐘旋轉7轉及半小時旋轉210轉為標準，計算達標只數。手術前1 d進行第1次，手術后第6、13天和20天分別進行第2、3次和四次阿樸嗎啡誘導旋轉實驗。

1.2.3RT-PCR檢測所有RNA操作用品均用0.1%DEPC水處理，用于RNA的試劑均用DEPC處理的水配制。使用Trizol試劑盒提取中腦組織細胞總RNA，測量總RNA的A260、A280及A260/A280，計算其總RNA的濃度和純度。用二步法進行PCR擴增目標RNA，2%瓊脂糖凝膠電泳顯色，凝膠圖像分析軟件進行電泳區帶的灰度掃描，計算各組指標的目的條帶/內參的灰度比值。各引物如表1。

表1　引物序列

1.2.4免疫組織化學檢測所有大鼠在手術后第20天完成行為學檢測后處死，取左側黑質固定后作連續病理切片，片厚4 μm。切片用抗TH單抗進行免疫組織化學染色后于光學顯微鏡下觀察，先在10倍物鏡下選擇TH陽性細胞密集區，然后在40倍物鏡放大倍數下進行陽性細胞計數，每個大鼠腦組織蠟塊的4張切片細胞數取平均值進行統計。使用同樣的方法對α-syn蛋白進行免疫組織化學染色，觀察其在大鼠中腦切片上是否有聚集現象及分布情況。

2結果

2.1行為學觀察所有大鼠在造模之前進行的阿樸嗎啡誘導旋轉行為中均未出現旋轉行為。模型組及治療組SD大鼠，在注射乳胞素后4 d，逐漸出現行為遲緩，對外界反應變得遲鈍，出現弓背姿勢，部分出現自發性旋轉。在注射乳胞素后第6天，檢測阿樸嗎啡誘導的旋轉行為，發現空白對照組中的大鼠沒有出現旋轉行為，而模型組及治療組中分別有4只和3只SD大鼠出現旋轉，速度在7 r/min以上，旋轉時間長于10 min；預治療組中則未見到大鼠的誘導旋轉行為。注射乳胞素后第13天進行阿樸嗎啡誘導旋轉實驗，空白對照組沒有SD大鼠發生旋轉行為；模型組中有7只SD大鼠出現旋轉行為，旋轉所維持的時間均比上次測試有所增加；治療組有5只大鼠出現誘導旋轉行為，預治療組中有2只大鼠出現旋轉行為(達到標準)。在第20天進行的旋轉誘導實驗與第13天進行的實驗結果相同。

2.2Lamp2A、HSP70 mRNA的表達水平結果分析Lamp2A平均吸光度比值各組間有顯著差異，治療組及預治療組平均吸光度比值較空白對照組及模型組均升高。HSP70平均吸光度比值各組間有顯著差異，治療組及預治療組平均吸光度比值較空白對照組及模型組均升高。見表2。

2.3α-syn染色結果模型組大鼠腦皮質和中腦神經元胞質內見到棕色的聚集成團塊狀的小結，散在分布，治療組及預治療組中大鼠神經元中聚集的α-syn蛋白比模型組中的聚集減少。

2.4TH免疫組織化學結果及分析圖1可見，空白對照組SD大鼠中，可見黑質染成棕色，大體觀呈倒眉毛狀；高倍鏡下，棕色染色集中在胞質和神經突觸。對黑質部位的多巴胺能神經元計數發現，腦內注射乳胞素的各組大鼠TH陽性細胞數較空白對照〔(55.64±6.35)〕組顯著減少，治療組〔(34.79±3.16)〕及預治療組〔(42.38±3.08)〕中陽性細胞數較模型組〔(19.96±2.31)〕多，使用雷沙吉蘭預治療組大鼠TH陽性神經元細胞數較治療組多。

表2　各組SD大鼠Lamp2A及HSP70 mRNA表達

與空白對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較:3)P<0. 05，4)P<0.01

圖1　各組大鼠TH免疫組織化學染色結果(DAB，×400)

3討論

隨著老齡化社會的到來，PD等老年人高發的神經變性疾病已經成為一個重要的社會問題〔10〕。目前PD的病因還不是十分清楚，遺傳和環境因素交互作用可能是主要的原因〔11〕。左旋多巴仍是目前治療的常用藥〔12〕，雷沙吉蘭也被認為具有神經保護作用而在臨床上協同左旋多巴進行治療〔13〕。在體內、體外及臨床實驗研究中發現〔3〕，雷沙吉蘭不僅能明顯的改善PD癥狀，而且具有能延緩PD進程的作用。結構分析顯示，其神經保護作用活性來自于藥物的炔丙基胺〔14〕。本實驗發現，使用雷沙吉蘭治療組SD模型大鼠TH陽性細胞數與預治療組有減少，模型組中TH陽性細胞數與治療組相比顯著減少，給予雷沙吉蘭預治療比治療可以更有效地保護神經元，延緩多巴胺能神經元的凋亡進程，也提示早期給予雷沙吉蘭能夠保護神經元。最近研究表明，PD的發病機制之一是細胞內錯誤蛋白聚積。已確定α-syn的聚積促進了多巴胺能神經元的丟失〔15〕。伴侶蛋白介導的自噬(CMA)可能參與調節多種與神經元功能相關的蛋白，其活性的改變也許與PD動物模型及PD病人的發病機制有關〔16〕。Lamp2A是CMA途徑的關鍵蛋白，其表達量的增加表明CMA作用增強〔17〕。本實驗發現，雷沙吉蘭能促進HSP70及Lamp2A的表達。HSP70蛋白與靶蛋白的KFERQ序列結合后，將識別的底物輸送至溶酶體表面與Lamp2A結合，形成溶酶體HSP轉位復合物，進入溶酶體內腔，迅速被降解〔18〕。CMA降解蛋白的作用在雷沙吉蘭藥物的作用下增強。

4參考文獻

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〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

基金項目：廣東省科技計劃項目(No.2010B060500015)

〔中圖分類號〕R742.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2065-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.007

1廣東醫學院病理生理學教研室

2廣東醫學院組織學與胚胎學教研室

第一作者：鮑波(1968-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事神經系統的病理生理研究。