芪薊腎康顆粒總黃酮對大鼠腎小球系膜細胞外基質動態平衡的干預實驗

楊冠琦, 張 君

(遼寧中醫藥大學附屬醫院, 沈陽 110032)

芪薊腎康顆粒總黃酮對大鼠腎小球系膜細胞外基質動態平衡的干預實驗

楊冠琦, 張 君

(遼寧中醫藥大學附屬醫院, 沈陽 110032)

目的 通過體外腎小球系膜細胞培養實驗，明確芪薊腎康顆粒總黃酮是否為組方的有效組分，探討其作用機制。方法 運用血管緊張素II誘導體外培養的腎小球系膜細胞，使細胞外基質增加, 經芪薊腎康顆粒總黃酮干預后, 觀察白細胞介素-6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、纖維粘連蛋白(FN)和IV型膠原(Col IV)的蛋白表達。結果 與Ang II組比較芪薊腎康顆粒總黃酮可降低IL-6、MCP-1的蛋白表達，FN和IV型膠原的含量也都分別降低(P＜0.01)。結論 芪薊腎康顆粒總黃酮可能是通過調節促炎癥因子的表達，從而抑制細胞外基質過度積聚。

芪薊腎康顆粒總黃酮; 白細胞介素-6(IL-6); 單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1);

黃酮化合物(Flavonoids) 在植物界中廣泛存在，而且具有豐富多樣的生理活性，許多中藥中黃酮化合物的含量都極為豐富。近年來，不斷改進的提取、分離技術，使黃酮類化合物的研究熱點已經由分離、提取高活性的黃酮類化合物，轉移到對其藥理作用的研究。過去的研究已經證實了芪薊腎康顆粒中具有益氣、化瘀、解毒作用的中藥, 可以通過調節細胞外基質相關降解酶，抑制由血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的細胞外基質的過度集聚[1,2]。為了明確芪薊腎康顆粒總黃酮是否為組方的有效組分并探討其作用機制，本實驗采用大孔樹脂吸附法提取顆粒中的總黃酮，運用血管緊張素Ⅱ誘導體外培養的腎小球系膜細胞, 使細胞外基質增加，經芪薊腎康顆粒總黃酮干預后, 觀察白細胞介素-6(IL-6)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、纖維粘連蛋白(FN)和IV型膠原(ColIV)的蛋白表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

SPF級SD大鼠15只，體質量200～220 g，雌雄各半，北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2011-0003]。HBZY-1大鼠原代腎小球系膜細胞株，武漢博士德生物技術有限公司，批號: CX0130。

1.2 實驗藥品與試劑

芪薊腎康顆粒總黃酮，由遼寧中醫藥大學藥學院提供; 血管緊張素Ⅱ，日本Wako公司(批號: 014-18211); 胎牛血清, 美國Gibico公司(批號: 8131650); DMEM培養液, 美國Hyclone公司(批號: SH30022.01B); IL-6、MCP-1、FN、ColIV ELISA試劑盒為中國Bio-Swamp公司產品 (批號分別為: A20607, RA20492、RA20618、RA20284）

1.3 主要儀器及設備

雙人超凈臺，蘇州凈化設備廠; 離心機，上海安亭科學儀器廠; 微孔板酶標儀，美國伯樂公司;倒置式顯微鏡，日本Olympus公司; 二氧化碳培養箱，美國Thermo Forma公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 芪薊腎康總黃酮藥理血清的制備 15只SD大鼠, 隨機分為正常組、芪薊腎康總黃酮高、低劑量組3組, 每組5只。芪薊腎康顆粒臨床給藥劑量為每日155 g/kg, 總黃酮高劑量組生藥量每日30 g/kg (大鼠與人2倍等效劑量)。低劑量組生藥量每日15 g/kg(大鼠與人等效劑量)灌胃, 1次/日; 正常組給予生理鹽水。連續灌胃5 d, 第5日灌胃1 h后,腹主動脈取血, 1 500 r/min離心5 min，吸取上層血清。滅活處理條件: 56 ℃水浴, 30 min。0.22 μm的濾器過濾除菌，-20 ℃保存備用。

1.4.2 腎小球系膜細胞的分組及培養 腎小球系膜細胞分為(1)正常組: 體積分數10%正常大鼠血清+DMEM; (2)模型組：AngⅡ(10-7mol/L)+體積分數10%正常大鼠血清+DMEM; (3)黃酮高劑量組: AngⅡ(10-7mol/L)+ 體積分數10%高劑量黃酮血清+DMEM; (4)黃酮低劑量組：AngⅡ(10-7mol/L)+ 體積分數10%低劑量黃酮血清+DMEM，每組設5個復孔。在25 cm2培養瓶中接種系膜細胞，加入培養液(含體積分數10%胎牛血清的DMEM), 培養條件: 37℃、體積分數5%的CO2。待細胞長滿培養瓶后, 換24孔培養板培養細胞, 接種密度: 2×104個/孔。體積分數0.5%胎牛血清+DMEM培養24 h后，更換藥理血清(體積分數10%)繼續培養48 h，收集細胞待測。

1.4.3 ELISA法檢測腎小球系膜細胞IL-6、MCP-1、FN、Col IV含量 應用酶聯免疫吸附法，嚴格按試劑盒所附說明書操作檢測。

1.5 統計學方法

實驗數據經SPSS11.0統計處理，進行單因素(One-Way)方差分析，表示, P＜0.01為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-6、MCP-1含量變化

經芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量干預48 h后，模型組IL-6、MCP-1分泌量與正常組比較均增加(P＜0.01)。經芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量干預后，IL-6、MCP-1分泌量與模型組比較均有顯著降低(P＜0.01)(表1)。

表1 大鼠腎小球系膜細胞IL-6、MCP-1含量 μmol/L

2.2 細胞外基質含量變化

經芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量干預48 h后，模型組FN、Col IV的分泌量與正常組比較顯著增加(P＜0.01)。芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量組與模型組比較降低了FN、Col IV的含量(P＜0.01)(表2)。

表2 大鼠腎小球系膜細胞FN、Col IV含量 mmol/L

3 討論

腎小球疾病的重要病理特點之一是系膜細胞的增殖和系膜基質明顯增多。而Ang II是RAS中最重要的效應分子, 通過調節炎癥和纖維化兩個關鍵過程, 參與腎臟疾病的發病機制[5]。Ang II與Ang II 1型受體(AT1)作用后，可引起系膜細胞的增生、肥大，分泌多種細胞因子并合成細胞外基質成分。AngII能使循環中的細胞粘附到系膜細胞，使炎癥細胞遷移到腎臟，從而導致炎癥細胞在腎臟的聚集，這個過程由粘附因子、細胞因子和趨化因子的上調所介導。Ang II通過AT1受體上調許多促炎癥基因的表達，如血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1) IL-6和MCP-1[6]。這些炎癥因子的表達和細胞外基質的積聚都是因為MAPK和NF-κB兩條信號轉導通路的激活[8-10]產生，最終導致腎臟損傷。

西醫學認為，腎病患者感染后，可以通過不同機制促發炎癥反應并產生大量的炎癥介質，例如IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等。作為攻擊性炎癥介質，它們的啟動激發了炎癥反應，使腎臟發生損傷。中醫學視感染為毒邪，當毒邪入侵，肺、脾、腎三臟功能失調，導致血尿、蛋白尿和水腫臨床癥狀的發生。所以本方按照扶正祛邪的治療原則和病因病機，確立益氣，解毒和化瘀的治法，優化院內治療腎小球疾病的協定處方。本方總黃酮成分主要來源于黃芪、小薊和仙鶴草。黃芪具有益氣固本之功, 重樓、仙鶴草具有清熱解毒之效。臨床試驗證實黃芪顆粒能夠通過抑制IgA腎病患者血清中MCP-1、TNF-α和IL-6的表達，改善臨床癥狀[11]。亦有文獻報道, 重樓可以調節免疫和炎癥反應，調控相關因子的分泌和炎癥遞質的表達。例如, 其可通過抑制膜性腎病大鼠腎臟NF-κB的活化，減少細胞外基質FN和ColIV的表達, 參與延緩膜性腎病腎小球病理損害的過程[12]。從仙鶴草中提取的山柰酚和槲皮素能夠抑制NF-κB的轉錄活性，從而控制各種炎癥因子的分泌，抑制炎癥反應的發生[13]。

本實驗結果表明: 芪薊腎康顆粒總黃酮高、低劑量組均降低了FN和Ⅳ型膠原的的蛋白表達，抑制了腎小球系膜細胞的積聚，說明細胞外基質是芪薊腎康顆粒的作用靶點，同時也確定了總黃酮為處方的有效組分。IL-6、MCP-1的含量同樣隨之減少，降低了炎癥細胞在腎臟炎癥反應中的趨化和激活作用，減少了炎癥細胞的浸潤，阻止了炎癥反應的發生。前期研究表明芪薊腎康顆粒總黃酮可以干預MAPK和NF-κB兩條信號轉導通路的表達，故推測芪薊腎康顆粒總黃酮可能通過調控以上兩種信號轉導通路，來減少促炎癥因子表達并抑制炎癥反應發生，使細胞外基質的分泌與降解恢復平衡，保護腎臟; 同時也說明了芪薊腎康顆粒組方原則的科學性和“益氣、解毒、化瘀”治法的有效性。

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Mechanism Analysis of Qiji Shenkang Total Granule Flavonoids on Regulating Glomerular Extracellular Matrix Dynamic Equilibrium through Inhibition of Inflammatory Response

YANG Guan-qi, ZHANG Jun
(Affiliated Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032, China)

ObjectiveThrough in vitro mesangial cell culture experiments, to explore if the total flavonoids of Qiji Shenkang Granule is the key effective component in the Fufang, and to further explore its mechanism. Method Used the macroporous resin adsorption method to extract total flavonoids in Fufang, and then use vascular tension angiotensin II to induce apoptosis in cultured mesangial cell membrane, which increased the extracellular matrix, after the intervention of total flavonoids of Qiji Shenkang Granule, analyzed the effect of interleukin 6 (IL-6) and monocyte chemotaxis protein-1 (MCP-1), fibronectin (FN) and type IV collagen (ColIV) protein expression.Resultsthe Qiji Shenkang Granule flavonoids in high, dose group significantly reduced IL-6 and MCP-1 protein expression, FN and collagen content were also reduced, compared with Ang II group, P＜0.01.ConclusionBy regulating the expression of pro-inflammatory factors, the total flavonoids in the Qi Ji Shen Kang Granule can inhibit the excessive accumulation of extracellular matrix.

Qiji Shenkang Granule total flavonoids; Interleukin 6(IL-6); Monocyte chemotaxis protein-1 (MCP-1); Fibronectin (FN); Type IV collagen (ColIV)

R285.5 Q95-33

A

1674-5817(2016)05-0357-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.05.006

2016-07-06

科技部重大新藥創制專項( 2009ZX09103-394),公益性行業科研專項(201507001-03)

楊冠琦(1983-), 女,博士研究生。

E-mail:y_g_q1983@163.com

張 君(1956-), 女, 碩士, 從事中醫兒科腎臟病研究。 E-mail: zhangjun555678@sina.com

纖維粘連蛋白(FN); IV型膠原(Col IV)