外陰陰道念珠菌病的藥敏及其基因的研究

張慧萍 嚴(yán)晨蘊(yùn) 盧彩玲

外陰陰道念珠菌病的藥敏及其基因的研究

張慧萍 嚴(yán)晨蘊(yùn) 盧彩玲

目的:研究念珠菌對(duì)抗真菌藥物的敏感性及其基因表達(dá)。方法: 對(duì)VVC患者的白帶標(biāo)本，培養(yǎng)分離真菌，利用API Candida 試劑鑒定菌種，采用瓊脂彌散法對(duì)檢出的菌株進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，以PCR擴(kuò)增法檢測CDR1、CDR2的基因表達(dá)。結(jié)果:分離出120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；光滑念珠菌23株（占19.2%）；白念珠菌對(duì)氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐藥率分別為1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；光滑念珠菌23株，對(duì)氟康唑和伊曲康唑的耐藥率分別為26.1%(6/23)和8.7%(2/23)。念珠菌CDR1、CDR2陽性表達(dá)率分別62.5%（75/120）和60.8%（73/120）。結(jié)論:白念珠菌是VVC的主要念珠菌。體外藥敏試驗(yàn)顯示念珠菌對(duì)制霉菌素均不耐藥。耐藥基因CDR1、CDR2在多種念珠菌中均有表達(dá)。

外陰陰道念珠菌病；耐藥性；基因；藥敏

外陰陰道念珠菌病（vulvovaginal candidiasis，VVC）是由念珠菌引起的女性最常見的一種生殖道感染，70%～90%由白念珠菌引起，非白念珠菌以光滑念珠菌最常見。不同念珠菌對(duì)不同藥物的敏感性不同,耐藥現(xiàn)象成為念珠感染治療的主要問題,現(xiàn)就外陰陰道念珠菌的藥敏及其基因分布進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2015年7月至2015年12月在我院門診診治的120例VVC患者，年齡為20-48歲，平均年齡30.3±6.3歲，患者均有典型的典型癥狀包括外陰瘙癢、灼熱、紅腫、性交痛、分泌物異常。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本的采集、培養(yǎng)、鑒定、藥敏

采用滅菌棉拭子，取陰道側(cè)壁及陰道后穹窿分泌物。對(duì)采集的標(biāo)本接種于沙保羅培養(yǎng)基，采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的API Candida 試劑盒進(jìn)行鑒定，采用丹麥Rosco公司生產(chǎn)的酵母菌藥敏片瓊脂彌散法進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)。

判讀標(biāo)準(zhǔn)參考Rosco提供的藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為白色念珠菌ATCC6454 。見表1。

表1 抗真菌藥敏試驗(yàn)判讀標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 念珠菌的DNA提取及PCR擴(kuò)增

共收集120株假絲酵母菌，取菌落接種于沙保羅肉湯培養(yǎng)液中以37℃培養(yǎng)24h后取將培養(yǎng)液置于離心試管中，離心機(jī)離心處理后取沉淀物，加入Solution A 500ul 充分混勻，37℃溫浴1h后加入Solution B 100ul充分混勻，70℃溫浴10min后加入Solution C 200ul充分混勻，冷卻5min、離心5min，取上清液置于新的EP試管中，加入異丙醇充分混勻后離心5min，取沉淀物加入冷卻的70%的乙醇液體500ul洗滌，離心5min取沉淀物干燥后加入TE Buffer溶解基因組DNA。CDR1、CDR2的基因序列引物及擴(kuò)增參考相關(guān)文獻(xiàn)[1]進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物以1.2瓊脂糖凝膠電泳，在專用的成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 念珠菌的菌種分布

120 例患者中共分離出120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；非白念珠菌37株（占30.8%），其中光滑念珠菌23株（占19.2%）；近平滑念珠菌和無名念珠菌各3株（各占2.5%）；克柔念珠菌、熱帶念珠菌和釀酒念珠菌各2株（各占1.7%）。

2.2 念珠菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

表2 光滑念珠菌對(duì)抗真菌藥物敏感性

白念珠菌對(duì)氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐藥率分別為1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；非白念珠菌對(duì)氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐藥率分別為16.2%(6/37)、5.4%(2/37)、0.0%(0/37)、5.4%(2/37)和0%(0/37)。

光滑念珠菌23株，對(duì)氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉素的敏感率分別為34.8%（8/23）、78.3%(18/23)、56.5%(13/23)、78.3%(18/23)和95.7%(22/23)。對(duì)氟康唑和伊曲康唑的耐藥率為26.1%(6/23)和8.7%(2/23)，對(duì)咪康唑、克霉唑和制霉素不存在耐藥菌株。

2.3 念珠菌耐藥基因檢測結(jié)果

念珠菌CDR1、CDR2陽性表達(dá)率分別62.5%（75/120）和60.8%（73/120）。

3 討論

隨著抗真菌藥物的廣泛應(yīng)用，念珠菌對(duì)抗真菌藥物耐藥性增加，念珠菌菌譜有了一定的變化，非白色念珠菌造成的VVC的比例在逐漸上升。Richter等對(duì)429例培養(yǎng)陽性的VVC患者進(jìn)行研究，共分離出593株念珠菌，其中白念珠菌420株，光滑念珠菌112株，近平滑念珠菌30株，克柔念珠菌12株，釀酒念珠菌9株，熱帶念珠菌8株，葡萄牙念珠菌和絲孢酵母各1株。本研究分離的120株念珠菌，白念珠菌83株（占69.2%）；非白念珠菌37株（占30.8%）。既往類似研究表明白念珠菌比例為20.1%～90%，光滑念珠菌則為18%～37%。

由于抗真菌藥物、免疫抑制劑等廣泛應(yīng)用，念珠菌的感染逐漸增多，真菌對(duì)抗真菌藥物的耐藥性也日趨嚴(yán)重，抗真菌藥敏試驗(yàn)有助于了解念珠菌株的耐藥性，為臨床治療外陰陰道念珠菌病提供用藥指導(dǎo)，對(duì)提高療效具有一定的參考意義。Richter等從429例VVC患者陰道分泌物中分離出593株念珠菌進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，對(duì)氟康唑的耐藥率為3.7%，對(duì)伊曲康唑的耐藥率為16.2%，對(duì)益康唑、克霉唑、咪康唑、酮康唑的耐藥率為1.5%～5.7%。其中74.1%的光滑念珠菌、58.3%的克柔念珠菌、55.6%的釀酒念珠菌和3.4%的近平滑念珠菌對(duì)伊曲康唑耐藥。所有的念珠菌對(duì)制霉菌素都敏感。SENTRY抗菌監(jiān)測項(xiàng)目報(bào)道，光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率達(dá)8.8%，對(duì)棘白菌素的敏感性降低，而且出現(xiàn)交叉耐藥[2]。本研究分離的白念珠菌對(duì)氟康唑、咪康唑、克霉唑、伊曲康唑和制霉菌素的耐藥率分別為1.2%（1/83）、8.4%(7/83)、1.2%(1/83)、4.8%（4/83）和0.0%(0/83)；光滑念珠菌23株，對(duì)氟康唑和伊曲康唑的耐藥率分別為26.1%(6/23)和8.7%(2/23)，對(duì)咪康唑、克霉唑和制霉素不存在耐藥菌株，光滑念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率明顯高于白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥率。本研究中，所有念珠菌對(duì)制霉菌素均不耐藥。Fan等在對(duì)283名復(fù)雜性VVC患者應(yīng)用氟康唑和制霉菌素進(jìn)行體外抗真菌藥物敏感性和臨床療效的研究中，共分離出287株念珠菌，對(duì)制霉菌素全都敏感。Beltaire等對(duì)1999年～2011年念珠菌對(duì)抗真菌藥物敏感性進(jìn)行回顧性分析，念珠菌對(duì)多烯類抗真菌藥物的敏感率為100%，基于研究結(jié)果，多烯類抗真菌藥物是治療真菌感染的首選藥物。多烯類抗真菌藥物是一種廣譜抗真菌藥物，與真菌細(xì)胞膜上的麥角固醇結(jié)合，增加細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致真菌死亡[3]。

有研究表明，無癥狀婦女和急性VVC患者念珠菌基因型存在差異。念珠菌對(duì)不同藥物的耐藥機(jī)制不同，對(duì)唑類藥物耐藥是耐藥菌細(xì)胞膜上外排泵基因的過度表達(dá)，唑類藥物作用的靶酶變異、念珠菌生物被膜的形成。外排泵基因過度表達(dá)導(dǎo)致14-a羊毛甾醇去甲基化酶作用位點(diǎn)處藥物濃度降低。耐藥相關(guān)基因CDR1、CDR2的存在是導(dǎo)致念珠菌對(duì)大多數(shù)唑類耐藥的重要機(jī)制，念珠菌GgCDR1、CgCDR2與唑類藥物交叉耐藥有關(guān)。本研究念珠菌CDR1、CDR2陽性表達(dá)率分別62.5%（75/120）和60.8%（73/120）,與文獻(xiàn)[4]報(bào)道一致。念珠菌無論是耐藥還是敏感，都存在CDR1和CDR2外排基因的表達(dá)，都有可能出現(xiàn)對(duì)抗真菌藥物的外排，但外排能力的產(chǎn)生并不代表念珠菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，耐藥現(xiàn)象是在多種機(jī)制共同作用下逐漸形成的[5]。

（作者單位：浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科）

[1]廖偉嬌，郭曉婧，江潔華，等．123株白色念珠菌耐藥基因CDRl 和CDR2表達(dá)研究[J]．中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(8)：1828—1830．

[2]侯欣，徐英春，趙玉沛. 念珠菌耐藥機(jī)制研究進(jìn)展.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2016,1:60-64.

[3]劉朝暉，王曉莉，廖秦平.復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病的菌群分析與治療.實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2009,25(12):730～732.

[4]雷云. 復(fù)發(fā)性外陰陰道假絲酵母菌病致病菌的藥敏及其基因分布.廣西醫(yī)學(xué)，2014,3:288-290.

[5]張麗梅，譚皓妍，徐韞健，等.耐藥基因CDR1、CDR2、ERG11、CaMDR1和FLU1在假絲酵母菌株中的分布情況，山東醫(yī)藥，2013，53（25）：20-22.

盧彩玲