低氧預適應對急性腦梗死小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6炎性反應因子的影響

張巧云　李思頡　牛敬忠　邵　國　吉訓明　張顏波*

(1.天津市東麗區萬新街社區衛生服務中心，天津 300000；2. 首都醫科大學宣武醫院低氧醫學研究所，北京 100053；3. 泰山醫學院附屬醫院神經內科，山東泰安 271000；4. 包頭醫學院生物醫學研究中心，內蒙古包頭 014060)

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低氧預適應對急性腦梗死小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6炎性反應因子的影響

張巧云1李思頡2牛敬忠3邵國4吉訓明2張顏波3*

(1.天津市東麗區萬新街社區衛生服務中心，天津 300000；2. 首都醫科大學宣武醫院低氧醫學研究所，北京 100053；3. 泰山醫學院附屬醫院神經內科，山東泰安 271000；4. 包頭醫學院生物醫學研究中心，內蒙古包頭 014060)

【摘要】目的 探討低氧預適應對急性腦梗死小鼠保護作用和血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6， IL-6)炎性反應因子的影響。方法采用數字表法隨機分為正常對照組(normal，N)、假手術組(control，C)、急性腦梗死組(cerebral infarction，CI)和低氧預適應(hypoxic preconditioning，HP)+急性腦梗死組(HP+CI) 4組，每組小鼠6只，共24只。復制低氧預適應和光化學急性腦梗死模型，行為學方法和ELISA法分別檢測神經功能缺損評分和TNF-α、IL-1β和IL-6濃度。結果N、C組無神經功能缺損癥狀；CI、HP+CI組均出現明顯神經功能缺損癥狀，CI、HP+CI組與N、C組相比，神經功能評分明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；HP+CI組與CI組相比，神經功能明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05)。CI、HP+CI組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6明顯升高，與N、C組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；HP+CI組與CI組相比，TNF-α、IL-1β和IL-6明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。結論低氧預適應對急性腦梗死具有保護作用，可能與減少TNF-α、IL-1β和IL-6炎性反應因子釋放，抑制急性腦梗死后炎性反應有關。

【關鍵詞】低氧預適應；急性腦梗死；神經功能評分；炎性反應因子

急性腦梗死是臨床上常見病、多發病，具有較高病死率和致殘率，對個人、家庭和社會帶來嚴重負擔，因此有效的治療和康復手段非常重要[1]。急性腦梗死后缺血性腦損傷機制復雜，多因素參與這一復雜病理生理過程，多種炎性反應因子在腦損傷中起重要作用[2-3]，其中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6， IL-6)是常見的炎性反應因子[4-5]。低氧預適應(hypoxic preconditioning， HPC)是一種內源性機體保護機制，可以作為缺血/缺氧性腦損傷一種無創的、有效的治療手段或方法，具有抑制炎性反應的作用。研究[6]證實HPC對缺血/缺氧性腦損傷具有保護和治療作用。目前HPC在缺血/缺氧性腦損傷后炎性反應過程中的研究較少，HPC的腦保護作用是否通過抑制TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子起作用，尚不明確。故本研究通過復制小鼠HPC和急性腦梗死模型，觀察HPC腦保護作用和對TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子的影響。

1材料與方法

1.1實驗試劑及儀器

冷光源(150 W、24 V金屬鹵化燈)，LG-150型，購自徐州恒達光學電子儀器有限公司；5%(質量分數)玫瑰紅購自美國Sigma公司；TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗動物與分組

清潔級Balb/c近交系小鼠，6～8周齡，體質量18～22 g，雌雄不拘，由首都醫科大學動物部提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2005-0006。采用數字表法隨機分為正常對照組(normal，N)、假手術組(control，C)、急性腦梗死組(cerebral infarction，CI)和低氧預適應(hypoxic preconditioning，HP)+急性腦梗死組(HP+CI) 4組，每組小鼠6只，共24只。

1.2.2HPC模型的建立

將小鼠放入1個125 mL的廣口瓶內，按照首都醫科大學神經生物研究室既往方法[7]復制HPC模型，N組無任何處理。

1.2.3急性腦梗死模型的制備

低氧預適應模型復制30 min后，按照首都醫科大學神經生物研究室既往成熟方法[8]，復制光化學法誘導小鼠腦皮質急性腦梗死模型，C組僅行冷光源照射，不注射玫瑰紅。

1.2.4小鼠神經功能評定

在急性腦梗死模型復制成功后24 h，按Garcia的6項方法[8]進行小鼠神經功能評分：①自發性活動；②四肢活動對稱性；③前肢伸展爬行動作對稱性；④籠壁抓力；⑤推軀干反應；⑥觸須反應。每項根據神經功能缺損程度不同，評分依次為0～3分，6項評分相加為總分。

1.2.5炎性反應因子檢測

神經功能評定后，各組動物斷頭，經頸動脈取血，離心取血清后，采用ELISA法檢測，根據TNF-α、IL-1β和IL-6試劑盒說明書完成：分別將血清或不同濃度標準品(100 μL/孔)加入相應孔中，室溫孵育 120 min。洗板5次，加入生物素化抗體工作液 (100 μL/孔)，室溫孵育60 min。洗板5次，加入酶結合物工作液(100 μL/孔)，避光室溫孵育20 min。洗板5次，加入顯色劑100 μL/孔，避光室溫孵育 20 min。加入終止液50 μL/孔，混勻后即刻測量A450值。

1.3統計學方法

2結果

2.1低氧預適應對急性腦梗死小鼠神經功能的影響

N、C組無神經功能缺損癥狀。CI、HP+CI組均出現明顯神經功能缺損癥狀，即自發性活動減少，四肢活動不對稱，前肢伸展爬行動作不對稱，籠壁抓力弱，推軀干反應遲緩，觸須反應緩慢。CI、HP+CI組與N、C組相比，神經功能評分明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；HP+CI組與CI組相比，神經功能明顯改善，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

2.2低氧預適應對急性腦梗死小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

CI、HP+CI組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的水平明顯升高，與N、C組相比，差異有統計學意義(P<0.01)；HP+CI組與CI組相比，TNF-α、IL-1β和IL-6的水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)，詳見表2。

表1　4組小鼠神經功能評分比較

表2　4組小鼠血清細胞因子水平比較

3討論

眾所周知，急性缺血性腦卒中是臨床常見的急重癥之一，病死率高，致殘危險性大，搶救急性腦梗死致腦缺血性損傷是其治療的關鍵，積極尋找腦缺血性損傷保護方法或藥物是研究的熱點。HPC是一種機體內源性保護機制，其通過一系列復雜環節調動機體潛能減輕缺氧損傷，對機體起保護作用[8-9]。在心臟缺血再灌注損傷、腦缺血再灌注、離體神經元及海馬腦片培養等模型研究發現，HPC對繼發損傷有保護作用。本研究結果表明，HPC能明顯增加急性腦梗死神經功能評分，改善腦梗死的預后。目前HPC的神經保護作用機制尚不明確。有研究[10]顯示，應用小鼠整體HPC和大腦中動脈阻塞模型(middle cerebral artery occlusion， MCAO)研究HPC對腦缺血性損傷的影響，從新奇型蛋白激酶C(novel PKC，nPKC)膜轉位的變化、腦衰蛋白反應調節蛋白-2(collapsin response mediator protein，CRMP-2)磷酸化水平、絲裂原和應激激活蛋白激酶1(mitogen-and stress-activated protein kinase 1，MSK-1)及cAMP反應元件結合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)磷酸化水平等方面探討相應保護機制[11-12]，HPC可在一定程度上改善MCAO小鼠的行為學表現，減少梗死面積和水腫程度；進一步研究機制發現，HPC能拮抗梗死區nPKC膜轉位水平的降低和皮質缺血核心區內CRMP-2磷酸化水平的降低；減少皮質缺血半暗帶內CRMP-2水解片段；提高缺血半暗帶內MSK-1及其底物CREB的磷酸化水平，參與MCAO腦損傷的腦保護機制[13-15]。但HPC是否通過抑制急性腦梗死后炎性反應起到腦保護作用，具體機制尚不明確。

中樞神經系統中靜止的小膠質細胞在缺血性損傷刺激下激活，在缺血性腦損傷等病理生理過程中釋放TNF-α等炎性反應介質，在繼發炎性反應中起重要作用[15]。TNF-α可促進星形細胞、內皮細胞產生趨化因子和黏附分子，同時促進IL-1β、IL-6等其他細胞炎性反應因子的釋放，進一步加重炎性反應[16]。其中IL-1β反過來可以促進小膠質細胞的激活，進一步分泌炎性反應因子外，還具有自分泌作用，通過這種炎性反應因子的放大循環作用，能加重炎性反應導致的腦損傷，促進神經元凋亡等；IL-6也具有協同TNF-α、IL-1β，增強炎性反應的作用，加重缺血性腦損傷[17]。所以抑制炎性因子進而抑制炎性反應，是改善急性腦梗死預后的重要方法。本研究結果表明，HPC能明顯減低急性腦梗死小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6濃度，具有抑制炎性反應因子釋放的作用，可能進一步減輕急性腦梗死損傷炎性反應，起到缺血/缺氧性腦損傷保護作用。

綜上，HPC對急性腦梗死具有保護作用，可能與減少TNF-α、IL-1β和IL-6炎性反應因子釋放，抑制急性腦梗死后炎性反應有關。但上述細胞因子的下游信號通路，還需要進一步研究。

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編輯慕萌

Effect of hypoxic preconditioning on the serum levels of TNF-α，IL-1β and IL-6 in mice with acute cerebral infarction

Zhang Qiaoyun1， Li Sijie2， Niu Jingzhong3， Shao Guo4， Ji Xunming2， Zhang Yanbo3*

(1.WanxinjieCommunityHealthCentre，DongliDistrictofTianjin，Tianjin300000，China； 2.InstituteforHypoxiaMedicine，XuanwuHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China；3.DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitaltoTaishanMedicalUniversity，Taian271000，ShandongProvince,China； 4.BiomedicalResearchCenter，BaotouMedicalCollege，Baotou014060，InnerMonguliaAutonomousRegion,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of hypoxic preconditioning on the serum levels of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)， interleukin-1 beta(IL-1β) and interleukin-6 (IL-6)in rats with acute cerebral infarction.MethodsTwenty-four rats were randomly divided into the four groups: normal control group(normal，N)， sham operation group(control，C)， acute cerebral infarction group(cerebral infarction，CI)， hypoxic preconditioning(hypoxic preconditioning，HP) and acute cerebral infarction group(HP+CI)， with 6 rats in each group. Models of hypoxic preconditioning and photochemical acute cerebral infarction were duplicated.Behavioral method and ELISA were used to respectively measure neurological deficit scores and the levels of TNF-α， IL-1β and IL-6.ResultsNo symptom of neurological deficit is shown in group N and C，while it showed up in group CI and HP+CI. The neurological scores in group CI and HP+CI decreased more clearly than those in group N and C (P<0.05). The neurological scores in group HP+CI improved significantly than those in group CI (P<0.05). The serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in group CI and HP+CI increased significantly than those in group N and C (P<0.05). The serum levels of TNF-α， IL-1β and IL-6 in group HP+CI decreased more clearly than those in group CI (P<0.05).ConclusionHypoxic preconditioning， can protect animals from acute cerebral infarction and the protection may related to inhibition of inflammatory reaction (subsequent to acute cerebral infarction) induced by the decrease in release of TNF-α， IL-1β and IL-6.

【Key words】hypoxic preconditioning； acute cerebral infarction； neurological function scoring； inflammatory cytokine

(收稿日期：2015-06-11)

【中圖分類號】R 743

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.01.017]

*Corresponding author， E-mail：bbnnbn@163.com

基金項目：低氧預適應轉化醫學北京市重點實驗室開放研究課題(2015DYSY02)。This study was supported by Open Research Project of Beijing Key Laboratory for Hypoxic Preconditioning and Translational Medicine(2015DYSY02).

網絡出版時間：2016-01-2718∶00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20160127.1800.018.html

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