小柴胡湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清中IL-17、IL-23及IL-27的影響

張　瑩，周小莉，戴　敏，吳　斌

(重慶市中醫院，重慶 400021)

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小柴胡湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清中IL-17、IL-23及IL-27的影響

張瑩，周小莉，戴敏，吳斌

(重慶市中醫院，重慶 400021)

[摘要]目的觀察小柴胡湯對膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27的影響，并探討其可能的作用機制。方法將40只Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、小柴胡湯低劑量組和小柴湯高劑量組，每組8只。除正常組外，其余組大鼠采用注射Ⅱ型膠原乳化劑的方法建立CIA模型。于首次注射Ⅱ型膠原乳化劑2周后開始，雷公藤多苷組給予雷公藤多苷20 mg/(kg·d)灌胃，小柴胡湯低、高劑量組分別給予小柴胡湯9 g/(kg·d)和18 g/(kg·d)灌胃，正常組給予等量生理鹽水灌胃，均連續4周。測量建模1周、2周后和灌胃1周、2周、4周后大鼠關節左右徑和前后徑，計算灌胃前和灌胃1周、2周、4周后關節炎指數，灌胃4周后采用ELISA法測定各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平。結果各給藥組灌胃后踝關節腫脹程度均明顯輕于模型組(P均<0.05)，關節炎指數及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組(P均<0.05)。結論小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL- 17、IL- 23、IL-27水平，可能是其治療類風濕關節炎的作用機制之一。

[關鍵詞]小柴胡湯；膠原誘導性關節炎；IL-17；IL-23；IL-27

類風濕關節炎(RA)是一種病因不明的系統性自身免疫性疾病，其發病機制尚未完全闡明，細胞因子的異常表達及相互作用在RA關節軟骨和骨質破壞方面起重要作用[1]。隨著人們對RA認識的不斷深入，發現Th17/Treg細胞比率失衡在RA發病過程中發揮著重要作用[2-3]，而IL-6、IL-23、IL-17和IL-27等相關細胞因子的異常表達與其比率失衡有密切關系[4-5]。RA屬于中醫痹證范疇，中醫少陽治痹古今有之，小柴胡湯是張仲景治療傷寒病見少陽證的代表方劑。筆者前期研究發現，小柴胡湯對膠原誘導性關節炎(CIA)大鼠有顯著的抗炎作用[6]，而對于新的臨床應用，則需要更多的藥理研究作為基礎。故本研究通過觀察小柴胡湯對CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平的影響，探討其作用機制，旨在為其臨床應用提供更多的依據。

1實驗資料

1.1材料

1.1.1動物SPF級雄性Wistar大鼠，體質量(200±20)g，購于第三軍醫大學實驗動物中心(動物合格證號：20120011)，籠中鼠顆粒飼料飼養，自由飲食，適應性飼養1周后進行實驗操作。

1.1.2試劑牛Ⅱ型膠原(奧多福尼生物科技，中國)，不完全弗氏佐劑(Sigma，美國)，IL-17、IL-23、IL-27 ELISA檢測試劑盒(Roche，瑞士)，水合氯醛(Life technologies，美國)，冰醋酸(生工生物，中國)。

1.1.3藥物雷公藤多苷片,遠大醫藥黃石飛云制藥有限公司提供，用時用蒸餾水溶解稀釋；小柴胡湯組方：柴胡24 g、黃芩9 g、半夏9 g、生姜9 g、黨參9 g、甘草9 g、大棗12 g，各味藥均由重慶市中醫院藥劑科提供飲片并煎制，濃縮液含生藥2 g/mL。

1.2方法將Wistar大鼠40只隨機分為正常組、模型組、雷公藤多苷組、小柴胡湯低劑量組和小柴胡湯高劑量組，每組8只。除正常組外，其余4組大鼠均建立CIA模型：用0.1 mmol/L醋酸10 mL溶解Ⅱ型膠原蛋白40 mg(4 ℃過夜)，再與10 mL的不完全弗氏佐劑均勻混合，于冰浴中充分乳化。在無菌條件下在大鼠尾根及背部多點皮內注射，初次免疫共注射乳劑0.2 mL，1周后予以加強免疫，同法再注射乳劑0.2 mL。初次免疫2周按關節炎指數(AI)對大鼠進行評分，AI>4分證明造模成功。之后小柴胡湯低劑量組給予小柴胡湯9 g/(kg·d)(通過成人用藥劑量與實驗動物用藥量換算公式換算而得)灌胃，小柴胡湯高劑量組給予小柴胡湯18 g/(kg·d)灌胃，雷公藤多甙組給予雷公藤多甙液20 mg/(kg·d)灌胃，正常組給予等量生理鹽水灌胃，均每天1次，連續4周。

1.3觀察項目

1.3.1關節腫脹程度游標卡尺測量各組大鼠雙后肢踝關節下緣左右徑和前后徑，每周1次。

1.3.2AI每周采用關節評分法對每只大鼠足爪關節進行評分，計算AI[3]。評分方法：0分為無紅腫；1分為趾關節稍腫，足爪或足墊單個區域炎癥；2分為關節輕度紅腫，足爪和足墊或踝關節2個區域以上的炎癥；3分為關節中度紅腫，輕度功能障礙；4分為關節重度紅腫，僵直甚至畸形，嚴重功能障礙。得分最高16分。

1.3.3血清IL-17、IL-23、IL-27水平灌胃4周后，從各組大鼠的球后靜脈叢取血，凝固后離心取血清，于-80 ℃冰箱保存。ELISA法測定血清IL-17、IL-23、IL-27水平。

2結果

2.1各組大鼠一般狀態正常組大鼠隨著飼養時間的延長，體質量增加，精神狀態好，鼠毛有光澤，行動自如，無異常狀態出現；模型組大鼠食欲減退，體質量逐漸下降，精神萎靡，鼠毛失去光澤，行動遲緩；給藥后大鼠食欲逐漸恢復，體質量有所增加，行動較前自如，精神狀態有所恢復。

2.2各組大鼠關節腫脹程度模型組建模2周后大鼠雙后肢左右徑、前后徑均明顯長于正常組(P均<0.05)。灌胃2周、4周后，各給藥組大鼠雙后肢左右徑及前后徑均明顯短于模型組 (P均<0.05)。小柴胡湯高、低劑量組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1及表2。

2.3各組大鼠AI比較灌胃2周、4周后各給藥組大鼠AI均明顯低于模型組(P均<0.05)；灌胃4周后小柴胡湯高劑量組AI明顯低于小柴胡湯低劑量組(P<0.05)，小柴胡湯高劑量組與雷公藤多苷組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平比較灌胃4周后，模型組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，各給藥組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組(P均<0.05), 而小柴胡湯高劑量組與雷公藤多甙組比較差異無統計學意義(P均>0.05)。見表4。

3討論

表1　各組大鼠不同時間關節左右徑比較±s，mm)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表2　各組大鼠不同時間關節前后徑比較±s，mm)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表3　各組大鼠不同時間AI比較±s，分)

注：①與模型組比較，P<0.05；②與小柴胡湯低劑量組比較，P<0.05。

表4　各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與小柴胡湯低劑量組比較，P<0.05。

RA以關節慢性炎癥及關節破壞為主，最終導致關節畸形而致殘。最新研究發現Treg細胞的抑炎作用及Th17細胞的促炎作用與RA發病密切相關，RA患者外周血Th17細胞比率明顯增加，Treg細胞比率降低，最終導致Th17/Treg細胞比率失衡，其可能與RA的發生發展及活動性有關[7-8]。

IL-17是Th17細胞分泌的主要細胞因子，其能介導炎癥反應，在RA的發病過程及治療中發揮著重要作用[9]。IL-17發揮致炎作用的途徑主要是通過誘導IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子以及趨化因子的表達，使炎癥細胞侵入關節局部組織而造成損[10]。研究發現，IL-17在RA患者血清及關節液中表達很高，其在RA發病中的作用主要表現在多種炎性細胞因子從滑膜細胞釋放，軟骨細胞基質的合成受到抑制，導致破骨細胞的活性增強，最終引起骨侵蝕[11]。最新研究報道，對于RA的治療，阻斷TNF-α及IL-17對于抑制細胞因子、趨化因子及基質酶的表達有非常重要的作用[12]。

IL-23是2000年發現并命名的IL-12家族成員，為異二聚體結構。IL-23能夠刺激CD4+細胞分化為Th17細胞，產生IL-17，并刺激基質細胞生成IL-6、IL-1、TNF-α等細胞因子，是RA發病過程中重要的促炎因子之一，在RA發病和骨破壞中起到了關鍵作用[13]。IL-23對Th17細胞的維持和擴增具有重要意義[14]。IL-23/IL-17軸在炎癥發生中起重要作用，其免疫通路失調使自身組織和抗原的免疫耐受遭到破壞，從而導致RA等自身免疫疾病的發生[15]。

IL-27是一種新的細胞因子，隸屬IL-12家族，在不同的自身免疫性疾病上可表現出抗炎和促炎雙重作用[16]。IL-27能促進分泌IL-10的Treg細胞分化，抑制Th17細胞的產生[17]；但也有學者指出，在缺乏感染編碼信號轉導和轉錄激活因子1(STAT1)時，IL-27能加速Th17的分化[18]。國內臨床研究發現， IL-27參與RA的疾病過程，并將是一個較好的反映RA活動的早期指標[19]。Moon等[20]研究發現，IL-27通過調節Th17及Treg細胞平衡，在改善CIA關節炎癥狀方面有潛在性的作用。

小柴胡湯由柴胡、黃芩、人參、半夏、甘草、生姜、大棗組成，具有疏利樞機、宣達上下、扶正祛邪的作用。本研究發現，各給藥組踝關節腫脹程度均明顯輕于模型組，AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于模型組，其中小柴胡湯高劑量組血清IL-17、IL-23、IL-27水平均明顯低于小柴胡湯低劑量組。提示小柴胡湯能顯著減輕大鼠踝關節腫脹程度，降低AI及血清IL-17、IL-23、IL-27水平。小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治療類風濕關節炎的作用機制之一。

綜上所述，小柴胡湯可降低CIA大鼠血清IL-17、IL-23、IL-27水平，可能是其治療RA的作用機制之一，其治療RA更多的作用機制還有待進一步研究。

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Effect of Xiaochaihutang on IL-17,IL-23,IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis

ZHANG Ying, ZHOU Xiaoli, DAI Min, WU Bin

(Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing 400021, China)

Abstract:Objective It is to observe the effect of Xiaochaihutang on IL-17, IL-23, IL-27 in serum of rats with collagen-induced arthritis(CIA)and to explore the possible mechanisms. Methods 40 Wistar rats were divided into nomal group, model group, tripterygium glycosides group, high and low doses of Xiaochaihutang groups. Rheumatoid arthritis model was established in rats in every group except normal group by type Ⅱ collage induction. In 2 weeks after first injection of type Ⅱ collage, tripterygium glycosides group was given tripterygium glycosides 20 mg/(kg·d) by lavage, low and high doses of Xiaochaihutang groups were given 9 g/(kg·d) and 18 g/(kg·d) Xiaochaihutang respectively by lavage, normal group was given the same volume of normal saline. All the groups were treated for 4 weeks. The left-right diameter and anterior-posterior diameter of joint of the rats were measured at one week, two weeks after model establishment, and at one, two, four weeks after lavage. The arthritis index was calculated before lavage, at one, two, four weeks after lavage. Four weeks after the treatment, the expressions of IL-17, IL-23 and IL-27 in serum were detected by ELISA. Results Compared with model group, the swelling of ankle joints and arthritis index of high and low doses of Xiaochaihutang groups reduced significantly (P<0.05). Xiaochaihutang groups and tripterygium glycosides group down-regulated the expressions of IL-23， IL-17 and IL-27 (P<0.05). Xiaochaihutang group was better than that of tripterygium glycosides control group (P<0.05). Conclusion Xiaochaihutang can reduce expressions IL-17, IL-23 and IL-27 in serum of CIA rats, it may be one of its mechanisms in the treatment of rheumatoid arthritis.

Key words：Xiaochaihutang; collagen-induced arthritis; IL-17; IL-23; IL-27

[收稿日期]2015-12-01

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)13-1391-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.13.008

[作者簡介]張瑩，女，碩士研究生，主治醫師，主要從事風濕病基礎與臨床研究工作。[通信作者]周小莉，E-mail:709885987@qq.com