利用SSR熒光標記毛細管電泳法檢測蝴蝶蘭組培突變體

肖文芳 李佐 陳和明 呂復兵

摘 要 以8份蝴蝶蘭種質資源為材料，使用SSR標記進行蝴蝶蘭種質資源和突變體的鑒定。從25對SSR熒光標記引物中篩選出10對擴增效果理想的SSR熒光標記引物，鑒定4個不同品種的蝴蝶蘭及其相應的突變體。10對SSR引物中有9對引物在這8個種質中能擴增出多態性條帶，共擴增出38個等位基因，利用其中3對引物SSR3+SSR8+SSR9的組合即可將4個品種及其突變體全部區分開，說明SSR熒光標記毛細管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

關鍵詞 蝴蝶蘭；組培突變體；SSR

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract In this research， four Phalaenopsis germplasms and their somaclonal mutants were used to identity mutants by fluorescent labeled simple sequence repeat（SSR）markers. Ten of 25 SSR primer pairs with good repeatability were selected，and then were labeled with fluorescent for amplification and capillary electrophoresis. Nine of 10 SSR primer pairs with high polymorphisms totally amplified 38 polymorphic alleles. SSR3， SSR8 and SSR9 could distinguish all of the samples. The present results provide valuable tools for the cultivar classification and somaclonal variation detection of Phalaenopsis.

Key Words Phalaenopsis； Somaclonal variation； SSR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.10.015

微衛星（Microsatellite），也稱為短串聯重復序列（short tandem repeats， STRs）或簡單重復序列（simple sequence repeats， SSRs），是指以幾個核苷酸（2～5個）為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列。微衛星廣泛分布于真核生物整個基因組的不同位置上，由于重復次數的不同及重復程度的不完全造成了每個位點的多態性。SSR具有信息含量高、呈共顯性遺傳，檢測時DNA用量少、操作簡便、多態性高、重復性好等特點，是分析種質資源遺傳多樣性，進行基因組作圖的重要手段。傳統的SSR檢測方法采用聚丙烯酰胺凝膠電泳加放射顯影或銀染的方法，費時費力低效。目前廣泛采用的毛細管電泳技術，其原理是利用ABI遺傳分析儀對熒光標記的DNA片段進行檢測，結合分子量內標進行DNA片段長度計算，使SSR分型變得高效快捷，重復性好，結果也更加精確。

SSR在蘭科植物上的應用不多，主要集中在種質遺傳多樣性和親緣關系的分析上[1-5]。

目前，國際植物新品種權保護聯盟（UPOV）的BMT分子測試指南中將SSR和SNP確定為構建DNA指紋數據庫的標準標記方法，由于SSR標記技術比較成熟，成為當前各個作物建庫的首選標記（UPOV，2007），已成功用于構建水稻、油菜、棉花、甘蔗、花生、棗、梨、百合等經濟作物的指紋圖譜，其中大部分均采用毛細管電泳檢測法[6-14]。而在突變體檢測方面，目前主要使用的分子鑒定方法為RAPD[15-16]、AFLP[17]和SSR，其中利用SSR對水稻空間誘變系[18-19]、棉花的組培突變體[20]和大豆的突變體庫[21]進行檢測，都得到了較好的檢測結果，但仍局限于傳統的凝膠電泳檢測法，未見結合更高效精確的毛細管電泳檢測手段。蝴蝶蘭作為重要的觀賞作物，經濟價值非常高，但相對其生產成本也高，生長周期較長，從組培苗到開花售賣約18個月。由于激素使用等原因，蝴蝶蘭種苗在組培生產過程中存在一定的變異幾率，而突變體并不符合商品生產的要求，會加大生產成本，不利于大規模商品化生產。所以高效的蝴蝶蘭突變體檢測技術非常必要。

本實驗利用SSR熒光標記毛細管電泳法對已在形態學上觀測到突變的蝴蝶蘭突變體進行檢測，探索SSR熒光標記毛細管電泳法在蝴蝶蘭突變體檢測上的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蝴蝶蘭植株 實驗采用4組相對變異的蝴蝶蘭突變體及其野生型，第1組為市場流行品種‘滿天紅及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第2組為市場流行品種‘光芒四射及其無白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第3組為市場流行品種‘V31及其具白色流彩狀鑲邊的花色突變體；第4組為本單位自主選育和審定的蝴蝶蘭紅花品種‘紅珍珠（粵審花2007004）及其晚花突變體（見圖1）。突變體均為本單位在組培及栽培過程中發現的自有突變體，經多年觀察及繁殖發現突變體的性狀均能穩定遺傳。所有實驗材料均種植于廣東省農業現代化科技示范區廣東省農業科學院環境園藝研究所溫室大棚內，棚內有專職人員種植養護。

1.1.2 試劑 化學試劑均購自廣州化學試劑廠；基因組DNA提取試劑盒為天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒；擴增試劑：2.5×Multiplex Buffer及Fast Taq DNA Polymerase來自北京閱微基因公司；ROX-500和ROX-800分子量內標來自北京閱微基因公司。

1.1.3 儀器 （1）Nanodrop 2000C核酸蛋白檢測系統（Thermo）；（2）BC-subMIDI電泳儀（北京六一儀器廠），電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）；（3）BioSens SC 810B凝膠成像儀（上海山富科學儀器有限公司）；（4）Centrifuge 5415D離心機（德國eppendorf公司）；（5）GeneAmp 9600 PCR儀（ABI公司）；（6）3730XL DNA analyzer（ABI公司）。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 蝴蝶蘭基因組DNA提取材料采用根尖0.2 g，按照天根生物科技（北京）有限公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒操作步驟進行，提取的DNA溶解在80 μL 1×TE溶液中。提取的DNA分別采用分光光度計檢測和瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物合成 引物分別采用3種不同顏色的熒光標記：FAM、HEX和TMR。根據前人研究結果，挑選了25條在蝴蝶蘭中擴增效果較好的引物進行擴增[5，22-24]，擴增產物大小介于150～750 bp之間，預測多集中于250～550 bp之間。經過篩選，其中10條引物（見表1）在本實驗中擴增結果較好，無雜峰，能擴增出穩定的DNA條帶。

1.2.3 PCR反應 進行單重PCR擴增，反應體系總體積為15 μL，其中含1.0 μL（50 ng/μL）DNA模板，6.0 μL 2.5×Buffer V緩沖液，0.1 μL（5 U/μL）Taq酶，上下游引物共1.0 μL（5 μmol/L），去離子水6.9 μL。SSR反應程序：95 ℃ 5 min，1個循環；94 ℃ 30 s，58 ℃ 35 s，35個循環；72 ℃ 35 s，60 ℃ 30 min，1個循環，最后降至15 ℃。

1.2.4 測序儀檢測及分析 96孔板中每孔加入分子量內標和甲酰胺混合液（0.5 ∶ 8.5）9 μL，PCR產物1.0 μL，95 ℃變性3 min后，上機進行多重混檢。1 kV電壓進樣10 s，電泳15 kV，30 min。將Data Colletion軟件收集的原始數據文件導入GeneMapper v4.0軟件進行分析，系統將各峰值的位置與其泳道中的ROX-500或ROX-800分子量內標予以比較，直接給出目標DNA片段的準確大小。各熒光標記座位上獨立進行3次重復的毛細管電泳檢測，取3次重復的平均值并四舍五入取整，作為實驗材料在該座位上的數據。

2 結果與分析

統計分析發現，基于8個實驗材料，10個SSR熒光標記共檢測到38個等位基因（見表2，圖2）。10個SSR熒光標記中只有SSR4沒有多態性，其余引物均能在一定程度上將各個品種或者正常株與突變體之間區分開。其中，SSR1和SSR6能夠將‘滿天紅及其變異株與其他的品種區分開，但是‘滿天紅及其變異株之間未能區分。SSR2不能區分‘紅珍珠及其變異株，但能將二者與其他的品種區分開。SSR3在‘滿天紅上表現出特異性缺失，而在‘滿天紅變異中則擴增出1條234 bp的條帶；在‘V31及其變異間檢測不到多態性，但是與其他3個品種有所區分；能夠將‘光芒四射和‘紅珍珠這2個品種、‘光芒四射及其變異區分開，但是不能將‘紅珍珠及其變異區分開。SSR5的結果將8個品種分為3組，滿天紅及其變異株條帶一樣，‘V31及其變異株條帶一樣，而剩下的4個品種條帶一樣。SSR7則能將4個品種都分開，但是每個品種與其變異株之間都不能檢測出差異。SSR8即能把‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個品種區分開，又能把3個品種與他們的突變體區分開。SSR9能夠將4個品種區分開，但在突變體區分中只能將‘紅珍珠及其突變體區分開。SSR10可以將‘滿天紅及其突變體和‘V31及其突變體區分開，而‘滿天紅、‘V31和‘光芒四射3個品種的擴增條帶各不相同，‘紅珍珠的擴增條帶則與‘V31一樣。

SSR3擴增‘滿天紅時和SSR9擴增‘光芒四射變異時都出現了特異性缺失，不能擴增出條帶，可能的原因有2種：（1）該SSR位點由于插入或者缺失而導致該位點缺失；（2）可能是該SSR位點的引物結合區發生點突變，導致引物不能結合。

從擴增結果可以發現，10個SSR引物中，SSR3+SSR8+SSR9的組合就能夠完全將4個品種及其突變體全部區分開，說明SSR熒光標記毛細管電泳法檢測蝴蝶蘭突變體高效可行。

3 討論與結論

突變體的產生主要來源于物理化學因素、組織培養和太空誘發[25-26]。蝴蝶蘭這類采用組培繁殖種苗的觀賞作物，其突變體除人為進行外，主要來源于組織培養。突變體鑒定方法共4種：（1）表型鑒定；（2）細胞學鑒定；（3）生物化學鑒定；（4）分子生物學鑒定。各種方法都有自己的優點和適用性。在蝴蝶蘭的突變體鑒定上，我們主要采用表型鑒定結合分子生物學鑒定，通過表型鑒定發現突變體，然后利用RAPD[27]或SSR等分子標記手段進行分子生物學鑒定，即首先通過表型鑒定篩選出相對于野生型有顯著差異外觀性狀的突變體，然后通過分子鑒定確定其從基因組水平上發生了變異，最終確定突變體為不受環境因素影響的可遺傳突變體。

本研究通過對4個蝴蝶蘭品種及其組培突變體的SSR分析，發現不同品種間及正常株與突變體間在一些SSR位點的基因型差異明顯，說明SSR標記可用于蝴蝶蘭組培突變體鑒別及品種鑒定。通過擴增結果可以發現，雖然‘滿天紅及其突變體與V31及其突變體、‘光芒四射及其突變體的表型變異類似，均表現為紅色的增多或者減少，但是擴增出的多態性條帶卻完全不同，說明3個突變體的變異可能是由不同的基因突變引起的。Su等[28]從蝴蝶蘭中克隆到F3′5′H基因的cDNA全長，利用基因槍法在蝴蝶蘭的花瓣中瞬時表達，花瓣在48 h內從粉紅色變成品紅色，說明F3′5′H基因的上調可能引起紅色素的增加；Han等[29]將pchs-1全長基因轉化到煙草中發現花的顏色變紅從而進一步證明了Pchs基因可能參與花朵的紅色素合成；是形成穩定花色素苷所必需的。Chen等[30]研究發現，在紅花蝴蝶蘭中類黃酮3-O-糖基轉移酶（flavonoid 3-O-glucosyltransferase，UFGT）基因大量表達，表達量顯著高于白花，而PeUFGT3-RNAi植株則表現出不同程度的褪色，且花青素含量明顯降低，說明UFGT基因與紅色花的形成高度相關。這些結構基因的表達變化都有可能引起花部色素含量的變化，進而導致花色的改變，另外調控花青素苷生物合成途徑中結構基因時空表達的3種轉錄因子R2R3-Myb、Myc基因家族的bHLH（basic helix-loop-helix）和WD40型轉錄因子[31]的變化也會引起花色的改變，所以三個突變體的表型雖然類似，成因卻各不相同。而‘紅珍珠晚花突變體的成因則可能與FT、SOC1和LFY等成花基因[32]的突變相關，Xiang等[33]從春蘭中克隆的FT同源基因CgFT在煙草中超量表達會出現早花表型，Huang等[34]從春蘭克隆的FT同源基因CgFT在擬南芥中超量表達會也導致轉基因擬南芥提早開花，說明FT基因會抑制成花，其突變體可能就會是晚花突變體。

從本實驗結果來看，在實際應用方面，前期的蝴蝶蘭高效檢測突變體技術非常必要。（1）從種質資源的收集利用來講，需要通過高效分子標記檢測表型相同或者不同的各類突變體來篩選出不同基因型的突變體，豐富種質資源的收集保存，減小重復保存，擴大相同表型的不同基因型種質資源，為蝴蝶蘭的分子生物學研究和生理生化研究奠定堅實的資源基礎；（2）從實際生產上來講，蝴蝶蘭由于生產規模大、成本高，在前期進行抽樣檢測，保證種苗的品種純正非常必要。從本實驗的數據可以發現，大部分的SSR特異性片段間大小的差異較小，有的小到只差2 bp，傳統的SSR檢測方法根本不能檢測到如此小的差異，毛細管電泳技術則能夠檢測小到1 bp的差異，使SSR分型變得高效快捷，實用性也更強，更適用于蝴蝶蘭的品種及突變體檢測鑒定。

當然，用分子標記對種質進行鑒定目前還處于研究階段，還存在不少問題，特別對于蝴蝶蘭這種原生種眾多、高度雜合的物種，基因組參考性較差，設計的引物并不一定和重要的形態性狀連鎖，并不能完全包含一個品種的所有信息。本實驗發現，針對大規模的生產檢測，SSR熒光標記毛細管電泳法檢測行之有效且高效低投入。但是如果是針對生物學實驗材料的鑒定檢測，還應與染色體水平、細胞學水平和形態水平等鑒定相結合，才能更加準確地描述一個品種的全部種質信息。

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