長白山野生藍(lán)莓中還原型谷胱甘肽含量的測定

樸泓潔　李鉉軍

摘要：為了解長白山野生藍(lán)莓中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量。本研究利用5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸（DTNB）衍生化法進(jìn)行了定量分析。得出藍(lán)莓中GSH的含量為1.0977±0.0264 毫升/克。每克藍(lán)莓粉末中GSH的含量達(dá)到0.8395毫升/克。

關(guān)鍵詞：DTNB； 藍(lán)莓；GSH

中圖分類號： TS255.7 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.21.030

谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，Glutathione）是一種同時(shí)具有γ-谷氨酰基和巰基的生物活性三肽化合物，作為生物體內(nèi)的非蛋白巰基化合物，谷胱甘肽主要有還原型（GSH）和氧化型（GSSG）兩種形態(tài)，在機(jī)體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽。臨床上，谷胱甘肽可以迅速提高機(jī)體免疫力，在抗氧化、抗輻射、清除自由基、解毒、促進(jìn)鐵質(zhì)吸收等方面具有良好的效果且無副作用；在食品加工領(lǐng)域，谷胱甘肽具有增強(qiáng)食品營養(yǎng)價(jià)值和強(qiáng)化食品風(fēng)味等功能。科學(xué)家們一直研究它在各種生物體內(nèi)的生理作用，其中GSH在人體各種組織細(xì)胞中的含量以及與各種疾病、組織損傷的關(guān)系至今仍然是研究的熱點(diǎn)[1-2]。藍(lán)莓，又稱篤斯、越橘，俗稱都柿，為杜鵑花科越橘屬野生落葉灌木，其果實(shí)為漿果，成熟后為藍(lán)紫色，球形或橢圓形，果皮有白霜。藍(lán)莓的果味鮮美、營養(yǎng)豐富，英國權(quán)威營養(yǎng)學(xué)家將藍(lán)莓列為15種健康食品之首，聯(lián)合國糧農(nóng)組織也將藍(lán)莓列為人類五大健康食品之一[3]。

本研究采用DTNB作為GSH的衍生化試劑進(jìn)行超聲波細(xì)胞破壁，這種操作可以對藍(lán)莓粉末破壁的同時(shí)又可以給衍生化試劑充分的反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行衍生化反應(yīng)而生成穩(wěn)定的GSH衍生化產(chǎn)物[4]。其目的是利用衍生化試劑所進(jìn)行的化反應(yīng)來避免巰基化合物從細(xì)胞內(nèi)流出時(shí)而被外界的其他化學(xué)環(huán)境破壞，從而生成穩(wěn)定的產(chǎn)物，利用其產(chǎn)物的顏色來進(jìn)行分光光度分析而得到樣品中的GSH含量及定性信息[5]。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器

1.1.1材料 藍(lán)莓購于延吉市千盛超市。

1.1.2試劑與藥品 5，5-二疏基-2，2-二硝基苯甲酸/DTNB、還原型谷胱甘肽、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、石油醚、海砂。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 JA-3100精密電子天平（深美儀器有限公司）；

FA1004電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；CX-100高速多功能粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）；DHG-907385-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；KQ-500DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDL-5000B冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PHS-3CpH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；

UV-1800紫外/可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；SJ-2028R榨汁機(jī)（佛山市順德區(qū)金宜美電器有限公司）；

80目網(wǎng)篩；索氏提取器。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1預(yù)處理工藝流程 藍(lán)莓→清洗→挑選（無蟲害、無病變）→榨汁→烘干（50℃）→粉碎→過篩（80目）→脫脂→低溫保存待用。

1.2.2預(yù)處理 在延吉市千盛超市購買今年新生長白山野生藍(lán)莓，進(jìn)行清洗后選擇充實(shí)飽滿無病害的藍(lán)莓，放入榨汁機(jī)中制成漿狀藍(lán)莓，取潔凈的稱量瓶，加10克海砂及一根小玻棒，置于50℃干燥箱中，干燥1.0小時(shí)后取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5小時(shí)后稱量，并重復(fù)干燥至恒重。然后稱取5～10克試樣（精確至0.0001克），置于蒸發(fā)皿中，用小玻棒攪勻放在沸水浴上蒸干，并隨時(shí)攪拌，擦去皿底的水滴，置50℃干燥箱中干燥4 小時(shí)后蓋好取出，放入干燥器內(nèi)冷卻0.5小時(shí)后稱量、保存，再用索式提取器對藍(lán)莓進(jìn)行脫脂，脫脂時(shí)間為大約12 小時(shí)左右，脫脂處理后把藍(lán)莓放入干燥箱內(nèi)揮發(fā)掉其中的石油醚，大約需要0.5小時(shí)，剝?nèi)ズＩ常詈蠓湃氲蜏貤l件下，以保存待用[7]。

1.2.3 DTNB衍生化分光光度法 GSH的定量分析原理是利用5，5'-二硫硝基苯甲酸（DTNB）衍生化試劑和植物材料同步破壁提取的樣品處理方法，采用分光光度法對枸杞中還原型谷胱甘肽（GSH）進(jìn)行定性、定量分析。藍(lán)莓樣品提取過程中GSH受破壁后胞外化學(xué)環(huán)境的影響導(dǎo)致氧化變性。利用5，5'-二硫硝基苯甲酸（DTNB）衍生化試劑同步提取，因生成穩(wěn)定的GSH的衍生化產(chǎn)物避免了GSH氧化變性導(dǎo)致的GSH分析信息丟失。用分光光度法測定GSH含量，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓中含有豐富的GSH。

GSH的定量分析原理是利用DTNB在pH值為7環(huán)境中與巰基發(fā)生反應(yīng)，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其離子呈黃色而且在波長409nm處有強(qiáng)烈的吸收峰，并且該吸收峰在過量的DTNB的溶液下其吸光度值與加入的GSH量呈良好的線性關(guān)系[6-7]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別在6個(gè)試管中分別加入（0毫升，0.2毫升，0.4毫升，0.6毫升，0.8毫升，1.0毫升）2×10-4mol/L的GSH溶液，然后分別對應(yīng)在6個(gè)不同濃度梯度的試管中分別加入25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2×10-4mol/LDTNB溶液和pH值為7.00的PBS緩沖液，充分混勻后，等待10分鐘，再調(diào)節(jié)pH至7.00在409nm下確定存在強(qiáng)吸收峰的λ值，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

GSH含量測定的具體操作方法：取25毫升（20mlDTNB+5mlPBS）含有2×10-4mol/LDTNB溶液和pH為7.00的PBS緩沖液作為提取液，在提取液中加入0.25克藍(lán)莓粉末，充分混勻后放入超聲波機(jī)中進(jìn)行震蕩破壁，工藝條件：500W，30分鐘。然后把提取液倒入離心管中進(jìn)行離心（6000r/min10min），離心后取出10毫升上清液，加入其2倍體積無水乙醇溶液，然后靜置30分鐘，在5000轉(zhuǎn)/分鐘轉(zhuǎn)速下離心10分鐘除蛋白，倒出上清液，調(diào)節(jié)酸堿度為pH為7.00，用分光光度計(jì)測定其吸光值，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對實(shí)驗(yàn)樣品中的GSH進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1GSH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

疏基與DTNB更適合在pH=7.00溶液中反應(yīng)后在409nm處測定。且實(shí)驗(yàn)中GSH的定量分析的原理是根據(jù)疏基與DTNB在pH為7.00的環(huán)境中發(fā)生反應(yīng)，生成3-羧基-4-硝基苯硫酚，其3-羧基-4-硝基苯硫酚溶液中離子的顏色為黃色且在波長409nm處具有強(qiáng)烈吸收峰值。從而可以得出在pH為7.00時(shí)的線性回歸方程為y=0.0354x+0.0236R2=0.9922。

2.2 GSH的含量分析

根據(jù)圖1，在pH為7.00時(shí)的線性回歸方程為y=0.0354

+0.0236R2=0.9922根據(jù)表1平均值0.149，得出x=3.5424

根據(jù)計(jì)算公式m=M×n

M-溶質(zhì)的摩爾質(zhì)量

n-樣品中GSH的物質(zhì)的量

m-樣品中GSH的質(zhì)量

由上可知在pH為7.00的環(huán)境下可測得藍(lán)莓樣液中GSH的物質(zhì)的量為2.88×10-5mol，從而可以推算出藍(lán)莓樣品中還原性谷胱甘肽的含量為（1.0977±0.0264）mg/g。每克藍(lán)莓粉末中GSH的含量達(dá)到0.8395毫克/克藍(lán)莓中的還原性谷胱甘肽含量里處于植物中等水平。

3結(jié)果與討論

DTNB衍生化法是在對長白山野生藍(lán)莓粉末細(xì)胞破碎的同時(shí)衍生化反應(yīng)也在進(jìn)行，這樣可以使GSH不易被外界其他的環(huán)境所影響變性，使反應(yīng)產(chǎn)物更加穩(wěn)定，測定結(jié)果的數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。在pH為7.00的條件下，疏基與DTNB反應(yīng)后在409nm有強(qiáng)吸收峰，在此光度下分析得出長白山野生藍(lán)莓中還原型谷胱甘肽（GSH）的含量1.0977±0.0264毫克/克，每克藍(lán)莓粉末中GSH的含量達(dá)到0.8395毫克/克。

我省長白山地區(qū)有豐富的野生藍(lán)莓資源，本研究為長白山野生藍(lán)莓資源的進(jìn)一步開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[3]聶飛，韋吉梅，文光琴.藍(lán)莓的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及其在我國產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的前景探討[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（01）：117-119.

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[7]周楠迪，李寅，陳堅(jiān)，等.從酵母中提取谷胱甘肽的初步研究[J]生物技術(shù)，1997（04）：30-33.

作者簡介：樸泓潔，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，在讀本科生，研究方向：食品分析。

通訊作者：李鉉軍，朝鮮族，碩士，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，講師，研究方向：食品分析。