長清茶抗氧化活性研究

黃翊鵬 張榮亭 張利云 姜慧玲 張珊

摘要：在測定多酚的基礎(chǔ)上，利用5種體外抗氧化模型（脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、羥基自由基清除作用、Fe²⁺絡(luò)合能力及Fe³⁺還原力）對長清靈巖茶與南方茶抗氧化活性進行了比較研究。結(jié)果表明：茶湯中多酚含量為長清綠茶[（0.3106±0.0054）m∥mL]>南方綠茶[（0.2888±0.0039）mg/mL]、長清紅茶[（0.1691±0.0029）mg/mL]>南方紅茶[（0.1560±0.0015）mg/mL]。長清茶的脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、Fe²⁺絡(luò)合能力及Fe³⁺的還原力均好于南方茶，且高于對照BHT、沒食子酸；長清茶的羥基自由基清除作用好于南方茶與沒食子酸，但低于BHT。因此，長清茶具有良好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：長清綠茶；長清紅茶；抗氧化活性；多酚

中圖分類號：S571.109.9

文獻標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2016）02-0053-05

濟南市長清區(qū)作為中國高緯度茶葉適生區(qū)，從20世紀(jì)50年代開始進行“南茶北引”實驗，恢復(fù)茶樹栽培種植以來，經(jīng)過不斷的生產(chǎn)品種改良和技術(shù)改進，茶葉面積、產(chǎn)量、產(chǎn)值持續(xù)增長，已逐步形成了集種植、采集、加工到定點銷售為一體，綠茶、紅茶、烏龍茶等多種茶葉多樣發(fā)展的特色產(chǎn)業(yè)格局。長清茶葉因其具有獨特的“香氣高、滋味濃、耐沖泡”等南方高山茶才有的品質(zhì)，日益受到消費者的青睞，并呈現(xiàn)出良好的發(fā)展態(tài)勢。

目前，關(guān)于南方茶有效成分及抗氧化作用方面的研究很多，但關(guān)于長清茶抗氧化作用方面的研究尚未見報道，尤其是關(guān)于長清茶與南方茶抗氧化作用的對比，一直缺乏理論依據(jù)。因此，本研究以長清茶和南方茶為樣品，在測定多酚含量的基礎(chǔ)上，以沒食子酸、BHT為對照，選取5種體外模型：脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH自由基清除作用、羥基自由基清除作用、Fe²⁺絡(luò)合能力、Fe³⁺還原能力，比較了長清茶與南方茶的抗氧化作用，以期為長清茶的品牌宣傳提供理論支持，為長清茶的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

長清綠茶、長清紅茶、南方綠茶、南方紅茶，均由山東立泰山茶業(yè)科技開發(fā)有限公司提供。

1.2 試劑與儀器

無水乙醇，95%乙醇，甲醇，30%雙氧水，鐵氰化鉀，三氯化鐵，六水三氯乙酸，無水碳酸鈉，福林酚試劑，卵磷脂，2-硫代巴比妥酸，BHT，沒食子酸，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，濃鹽酸，硫酸亞鐵，DPPH，水楊酸，F(xiàn)errozine鐵試劑等，均為分析純。

HI2221型pH計（哈納儀器）；UV-9000型紫外/可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；離心機（美國貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；Auv120分析天平（SHIMADAZU公司）；HWS-2電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理 準(zhǔn)確稱取5g樣品于150mL沸水中浸泡5min，立即用紗布過濾，冷卻后用濾紙過濾，將濾液稀釋10倍后備用。

1.3.2 多酚含量的測定取0.1mL待測液加入2%的Na²CO³2.0mL，靜置2min，加入50%福林酚試劑0.1mL，靜置30min，在720nm處測吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品配制標(biāo)準(zhǔn)液，按上述方法繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，用沒食子酸當(dāng)量表示多酚含量。

1.3.3 脂質(zhì)過氧化抑制作用的測定硫酸亞鐵-Vc溶液的配制：分別取347.5mgFeSO⁴和35mgVc，用蒸餾水定容至25mL。顯色劑的配制：取15g三氯乙酸、0.375g硫代巴比妥酸、

2.1 mL濃HCl，用蒸餾水定容至100mL。

以PBS緩沖液（10mmol/L，pH7.4）為溶劑配制10mg/mL的卵磷脂溶液。在試管中加入2mL待測液，再依次加入0.1mL卵磷脂溶液、50μL硫酸亞鐵-Vc溶液，用PBS緩沖液（10mmol/L，pH7.4）定容至3mL。37℃水浴40min，加入2mL顯色劑，沸水浴15min，5000r/min離心10min，在532nm處測吸光度。用BHT、沒食子酸作對照。

脂質(zhì)過氧化抑制率（%）=

1.3.4 DPPH自由基（DPPH·）清除作用的測定將0.1mL待測液加入1.4mLO.1mmol/LDPPH乙醇溶液中，95%乙醇定容至3mL，避光靜置30min。在517nm處測吸光度，模型管用乙醇代替樣品，用BHT、沒食子酸作對照。

DPPH·清除率（%）=

1.3.5 羥基自由基（·0H）清除作用的測定取0.088mol/LH₂O₂溶液0.25mL于試管中，加入9.Ommol/L FeSO₄溶液0.25mL，9.1mmol/L水楊酸一乙醇溶液0.25mL，用待測液定容至5mL，搖勻，靜置反應(yīng)3min，在510nm處測吸光度。用BHT、沒食子酸作對照。

·OH清除率（%）=

1.3.6 Fe²⁺絡(luò)合能力的測定取50μL待測液，加入1mmol/L FeSO₄溶液25μL，5mmol/LFerrozlne鐵試劑溶液50μL，靜置10min，用甲醇溶液補足至3mL，在562nm處記錄吸光度。模型管用甲醇代替待測液，用BHT、沒食子酸作對照。

Fe²⁺絡(luò)合率（%）=

1.3.7 Fe³⁺還原能力的測定取200μL待測液，加入PBS緩沖液（0.2mmol/L，pH6.6）1mL，1%鐵氰化鉀溶液1mL，50℃水浴20min，加入10%三氯乙酸1mL，4000r/min離心10min，取上清液2mL，加入蒸餾水2mL、0.1%三氯化鐵400μL，混勻，在700 nm處記錄吸光度。用BHT、沒食子酸作對照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和SPSS軟件進行統(tǒng)計和分析，數(shù)據(jù)用平均值±SD表示，平均數(shù)之間的多重比較采用Duncan's新復(fù)極差檢驗方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚含量的測定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖l所示，當(dāng)沒食子酸濃度在0.01-0.04mg/mL之間時，反應(yīng)顯色靈敏、穩(wěn)定，具有良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=0.0559x+0.0004，R?=0.9969，式中y表示沒食子酸濃度，x表示吸光度。

以沒食子酸當(dāng)量表示多酚含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出，長清綠茶、南方綠茶、長清紅茶、南方紅茶茶湯稀釋后多酚含量分別為：（0.0310±0.0005）、（0.0288±0.0004）、（0.0169±0.0003）、（0.0156±0.0002）mg/mL，表明無論綠茶、紅茶，長清茶茶湯多酚含量高于南方茶。

2.2 脂質(zhì)過氧化抑制作用的測定

在測定兩種茶樣茶湯多酚含量的基礎(chǔ)上，以沒食子酸和BHT作為對照，進一步測定了其抗氧化活性。由圖2、圖3可知，長清綠茶的脂質(zhì)過氧化抑制率最高，可達95.48%，南方綠茶次之，為95.41%，BHT為81.07%，沒食子酸最低，為64.32%；長清紅茶的脂質(zhì)過氧化抑制率為96.34%，南方紅茶為96.20%，BHT為74.23%，沒食子酸最低，為52.47%。長清茶的脂質(zhì)過氧化抑制作用要略高于南方茶，兩者間無顯著差異（P<0.05），但均顯著高于對照。

2.3 DPPH自由基（DPPH·）清除作用的測定

由圖4、圖5可知，無論是綠茶還是紅茶，長清茶的DPPH自由基清除率均顯著高于南方茶與兩種對照。對DPPH自由基清除率大小順序依次為：長清綠茶（89.12%）>南方綠茶（86.28%）>沒食子酸（68.03%）>BHT（6.69%）；長清紅茶（78.23%）>南方紅茶（70.98%）>沒食子酸（39.57%）>BHT（6.46%）。

2.4 羥基自由基（·OH）清除作用的測定

羥基自由基是對人體毒性最大的自由基，常作為判斷待測物是否具有抗氧化性的指標(biāo)。由圖6、圖7可知，BHT對羥基自由基的清除能力最強，沒食子酸最弱，不論是綠茶還是紅茶，長清茶要顯著高于南方茶。綠茶對羥基自由基的清除率由大到小的順序為：BHT（67.63%）>長清綠茶（8.30%）>南方綠茶（5.68%）>沒食子酸（0.68%）；紅茶對羥基自由基清除率大小的順序為：BHT（69.15%）>長清紅茶（24.80%）>南方紅茶（10.40%）>沒食子酸（0.89%）。

2.5 Fe²⁺絡(luò)合能力的測定

Fe²⁺能夠催化Fenton反應(yīng)導(dǎo)致羥基自由基的生成，多酚類物質(zhì)能與Fe²⁺絡(luò)合，減少羥基自由基的生成，間接抑制脫氧核糖降解。由圖8、圖9可知，長清綠茶的Fe²⁺絡(luò)合率最高，為14.32%，顯著高于南方綠茶（9.14%）、BHT（7.34%）、沒食子酸（3.54%），南方綠茶和BHT的Fe2+絡(luò)合能力無顯著差異（P<0.05）；長清紅茶的Fe²⁺絡(luò)合率為9.78%，顯著高于BHT（6.29%）、南方紅茶（3.96%）、沒食子酸（1.00%）。可見，無論是綠茶還是紅茶，長清茶均顯示出較好的Fe²⁺絡(luò)合能力，而南方茶與BHT的Fe²⁺絡(luò)合能力沒有顯著差異。

2.6 Fe³⁺還原能力的測定

還原能力是表征物質(zhì)在氧化還原反應(yīng)中給出電子、自身發(fā)生氧化的能力，既是物質(zhì)抗氧化活性的重要表現(xiàn)，又是對其抗氧化能力的合理解釋。實驗研究中通常采用三價鐵離子還原法觀察物質(zhì)的還原能力，以吸光度表示結(jié)果，吸光度值越大，說明樣品的還原能力越強。由圖10、圖II可看出，長清綠茶的Fe³⁺還原力（1.16）顯著高于南方綠茶（1.12）與BHT（O.10）和沒食子酸（0.13），長清紅茶（0.46）的Fe3+還原力顯著高于南方紅茶（0.45）與BHT（O.09）和沒食子酸（0.03）。

3 討論與結(jié)論

越來越多的研究表明，茶的許多抗氧化活性指標(biāo)都與茶多酚含量有明顯的正相關(guān)性。陳金娥、陳雪等的研究表明，DPPH自由基清除作用與茶多酚和兒茶素含量呈正相關(guān)；趙國玲等對不同種類海藻多酚含量和還原力的對比研究發(fā)現(xiàn)，三類海藻的多酚含量和還原力之間顯著正相關(guān)；孫怡對冬青苦丁茶及大葉冬青苦丁茶的研究也表明，羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率、Fe³⁺還原力均呈正相關(guān)性；曹煒等的研究表明，不同種蜂蜜的總酚酸含量越高，其脂質(zhì)過氧化抑制作用越高；何秋彤研究表明，不同木錦花提取物的抗氧化性都在不同程度上與總酚含量呈正相關(guān)，但對20種涼茶的研究表明，茶多酚含量與脂質(zhì)過氧化抑制能力沒有明顯的相關(guān)性，涼茶試樣的總酚含量與其抗氧化能力之間的相關(guān)性不顯著。長清綠茶、紅茶茶多酚的體外抗氧化試驗表明，抗氧化活性與多酚含量有明顯的正相關(guān)性。長清綠茶、紅茶具有一定的脂質(zhì)過氧化抑制作用、DPPH和羥基自由基的清除能力、Fe²⁺絡(luò)合能力以及Fe³⁺還原力，對于不同的體系清除效果有所不同。

據(jù)報道，苦丁茶粗提物的濃度為0.3589mg/mL時，DPPH，清除率為50%。鄭海燕研究表明，茶多酚濃度為0.8mg/mL時，紫陽綠茶和西鄉(xiāng)綠茶多酚的羥基自由基清除率分別為60%和54%。杏花花粉的醇提物對卵磷脂氧化抑制作用的IC50，為（4.0353±0.2525）mg/mL。桑葉70%醇提物對Fe²⁺絡(luò)合能力的IC50為20.89mg/mL。而本試驗用沸水浸提得到的長清綠茶茶湯[（0.0310±0.0005）mg/mL]的DPPH自由基清除率為89.12%，羥基自由基的清除率為8.30%，脂質(zhì)過氧化抑制率為95.48%，F(xiàn)e²⁺絡(luò)合能力為14.32%；長清紅茶茶湯[（0.0169±0.0003）mg/mL]的DPPH自由基清除率為78.23%，羥基自由基的清除率為24.80%，脂質(zhì)過氧化抑制率為96.34%，F(xiàn)e²⁺絡(luò)合能力為9.78%。表明長清茶具有較好的抗氧化能力，明顯優(yōu)于南方茶，這可能是由于長清茶較南方茶種植緯度高、晝夜溫差大、葉片厚、茶葉中多酚類物質(zhì)含量較南方茶多的緣故。本研究從體外抗氧化活性這一角度對比了長清綠茶、紅茶與南方綠茶、紅茶，為進一步開發(fā)利用長清茶提供了理論支持和科學(xué)數(shù)據(jù)。