基于高效液相色譜法測定飲料中咖啡因分析

袁雪晴

摘要：文章對基于高效液相色譜法測定飲料咖啡因的含量進行分析與探討，首先對高效液相色譜法所需的材料試劑以及儀器設備配置情況進行初步分析，然后對實驗結果進行系統分析與討論，以驗證本方法用于飲料樣品中咖啡因含量測定的可行性，僅供參考。

關鍵詞：飲料;咖啡因;高效液相色譜法

1 實驗方法

實驗所需材料與相關試劑均由XX生化科技股份有限公司提供，甲醇為HPLC級，濃度99.9%以上，其他相關試劑為分析純。咖啡因標準溶液配制方法如下：精密稱取一定劑量純咖啡因溶液至標準容積為1000.ml容量瓶中，經超純水定容至標準刻度，得到咖啡因標準儲備溶液，充分混合均勻后靜置備用。測定前取適量溶液至標準容積為100.0ml容量瓶中，逐級稀釋并得到相應濃度標準的咖啡因標準使用液。飲料樣品溶液先經0.22um水性微孔膜充分過濾，在此基礎之上經高效液相色譜法直接分析，有需求的情況下對飲料樣品進行稀釋后分析。實驗所需的相關設備儀器包括高效液相色譜儀，產品型號為LC-20AT，配置有SPD-20A紫外檢測器以及自動進樣器裝置，進樣體積為10.0uL，同時配置紫外分光光度計，設備型號為DR6000，檢測波長區間為190～1100nm。

2 結果分析

1）流動相流速。以柱溫35.0℃以及流動相比甲醇：水為1：1的情況下，對流動相流速相對于飲料樣品中咖啡因保留時間以及色譜峰面積的影響情況進行考察與研究，進行3次平行實驗并以平均值為參考值，形成如下圖（見圖1）所示曲線。結合圖1可見，在流動相流速不斷增加的情況下，與之相對應的色譜峰面積以及保留時間均呈現出下降趨勢，色譜峰面積大，有較高的靈敏度，保留時間短且操作費用低。因此，經綜合因素考量，在基于高效液相色譜法對飲料中咖啡因成分進行測定時，為確保分析靈敏度高，同時縮短分析時間，提升分析效率，建議將流動相流速控制為1.0ml/min。

2）柱溫。在流動相比甲醇：水為1：1且流動相流速為1.0l/min的情況下，對柱溫相對于飲料樣品中咖啡因保留時間以及色譜峰面積的影響情況進行考察與研究，進行3次平行實驗并以平均值為參考值，形成如下圖（見圖2）所示曲線。結合圖2可見，在柱溫升高的情況下，飲料樣品中咖啡因保留時間呈現出反向下降關系。柱溫升高意味著傳質阻力得到明顯改善，對提升柱效，增加靈敏度，縮短分析時間等均具有非常確切的效果。但與此同時，柱溫過高的情況下會對整個高效液相色譜法的選擇性產生影響，組分分離難度增加，且固定相有效成分可能發生流失，嚴重時還會導致色譜柱的損壞。因此，在基于高效液相色譜法對飲料中咖啡因成分進行測定時，為確保分析靈敏度高，提升分析效率，保護有效組分，建議將柱溫控制為35.0℃。

3）精密度。對不同濃度的咖啡因溶液進行配置，不同濃度進行7次平行實驗。以相對標準偏差表示方法精密度。實驗結果如下：A組7次測定值平均值為0.092mg/l，標準偏差為0.00126，相對標準偏差為1.37%;B組7次測定值平均值為0.45mg/l，標準偏差為0.00616，相對標準偏差為1.38%;C組7次測定值平均值為0.98mg/l，標準偏差為0.00707，相對標準偏差為0.73%;D組7次測定值平均值為1.88mg/l，標準偏差為0.01300，相對標準偏差為0.69%;E組7次測定值平均值為4.50mg/l，標準偏差為0.05356，相對標準偏差為1.19%;F組7次測定值平均值為9.41mg/l，標準偏差為0.03323，相對標準偏差為0.35%;G組7次測定值平均值為28.24mg/l，標準偏差為0.2668，相對標準偏差為0.94%;H組7次測定值平均值為46.11mg/l，標準偏差為0.4331，相對標準偏差為0.94%;I組7次測定值平均值為72.36mg/l，標準偏差為0.4600，相對標準偏差為0.63%;J組7次測定值平均值為92.92mg/l，標準偏差為0.10012，相對標準偏差為0.11%。結合以上數據可見，咖啡因相對標準偏差位于0.11%～1.38%區間范圍內。

3 結束語

本文構建了基于反相高效液相色譜法對飲料樣品中咖啡因含量進行測定的體系，通過試驗的方式確定流動相速度以及柱溫等反應條件，并對方法精密度進行驗證，得到以下幾個方面的結論：（1）在基于高效液相色譜法對飲料中咖啡因成分進行測定時，為確保分析靈敏度高，同時縮短分析時間，提升分析效率，建議將流動相流速控制為1.0ml/min;（2）在基于高效液相色譜法對飲料中咖啡因成分進行測定時，為確保分析靈敏度高，提升分析效率，保護有效組分，建議將柱溫控制為35.0℃;（3）咖啡因相對標準偏差位于0.11%～1.38%區間范圍內。

參考文獻：

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