受體胚齡對雞原始生殖細胞移植后歸巢的影響

陳美娟 陳東陽 謝龍 陸振萍 楊蒙蒙 莫麗芬 盧克煥 陸陽清

摘要：【目的】探究受體胚齡對雞原始生殖細胞（Primordial germ cell，PGC）移植后歸巢的影響，確定最佳回注時間窗口，為提高轉基因雞的生產效率提供參考依據。【方法】從廣西黃羽雞胚分離獲得PGC，體外培養并進行轉基因操作后，移植回注到不同胚齡的受體雞胚中，移植5 d后分離性腺拍照觀察，對比受體雞胚孵育至14HH～17HH時對PGC遷移歸巢到性腺的影響。【結果】分別在14HH～17HH胚齡時移植回注PGC，移植5 d后的雞胚死亡率為30.0%～

60.9%，但不同移植胚齡間的差異不顯著（P>0.05）。根據雞胚性腺中的GFP陽性細胞數可劃分為6個等級（I～VI），且隨著移植胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢。14HH胚齡移植的雞胚性腺GFP陽性細胞集中在V級（40.0%），15HH胚齡移植的集中在III級（42.1%），16HH和17HH胚齡移植的則集中在II級（45.4%和54.5%），GFP陽性細胞含量最高等級（VI級）僅出現在14HH胚齡移植的雞胚性腺中。【結論】隨著受體胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢，但鑒于實際操作的難易程度，確定PGC移植回注的最佳時間窗口為14HH雞胚（孵育50 h）。

關鍵詞： 雞；原始生殖細胞；移植胚齡；遷移效率；轉基因

中圖分類號： S831 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-1014-05

0 引言

【研究意義】禽類在畜牧業生產中占據重要地位，且作為模型動物已廣泛應用于發育生物學及醫學研究。相對于其他哺乳動物，禽類具有獨特的優勢，如繁殖周期短、個體小、飼養成本低、胚胎易于操作等（徐國正等，2007；李俊營等，2014；吳雙等，2014）。由于禽類胚胎發育模式的特殊性，其受精卵從體內產下時已是一個含有幾萬個細胞的早期胚胎，導致禽類受精卵轉基因技術受到限制。原始生殖細胞（Primordial germ cell，PGC）作為配子的前體細胞，能將遺傳信息傳遞給下一代，若能分離培養PGC并進行基因操作，移植生成的精子或卵子將可用于生產轉基因動物。【前人研究進展】近年來，許多有關PGC起源及遷移的研究證實禽類PGC具有獨特的遷移方式。Nakamura等（2007）研究發現，雞PGC起源于上胚層，孵育至10HH時集中于頭部，11HH開始進入血脈系統，14HH時在血液中達到峰值，然后向生殖脊遷移，至17HH時歸巢生殖脊處。李碧春等（2010）研究證實，雞PGC在發育過程中以血液系統為載體從生殖新月區遷移到性腺。禽類PGC的遷移規律為分離PGC體外培養并進行基因操作提供了依據，同時使得利用PGC生產轉基因禽類具有可行性。根據PGC在雞胚體內的遷移及分布情況，Shiue等（2009）從孵育5.5 d的雞胚性腺中分離獲得性腺PGC，并在體外進行長期培養；Tonus等（2014）從孵育至13HH～18HH的雞胚血液中成功分離獲得PGC。PGC經過體外培養及基因修飾后，仍保持其生物學特性，回注到雞胚血脈系統后可遷移到性腺并發育成功能性配子，產生轉基因后代（van de Lavoir et al.，2006）。【本研究切入點】在利用PGC為載體進行家禽基因操作過程中，由于PGC遷移僅發生在特定的時間窗口，因而受體胚齡將影響PGC遷移及生殖系嵌合體雞的制備效率，但至今鮮見有關受體胚齡對雞PGC移植歸巢影響的研究報道。【擬解決的關鍵問題】探析廣西黃羽雞胚孵育至14HH～17HH時回注PGC細胞的效果，確定最佳的PGC回注時間窗口，為提高轉基因雞的生產效率提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗種蛋來源及孵育

種蛋為廣西黃羽雞蛋，由廣西富鳳農貿有限公司提供。雞胚孵育溫度37.8 ℃，相對濕度60%，孵育期按Hamburger和Hamiltion（1992）標準進行劃分。

1. 2 細胞來源及培養

從孵育至14HH～15HH的黃羽雞胚血液中分離獲得PGC。PGC接種至經γ射線處理的MEF飼養層上，用CKO培養液進行培養，培養箱參數37 ℃、5% CO2。CKO培養液中含66% KO-DMEM、20% BRL培養液、7.5%特級胎牛血清（FBS）、2.5% Chicken Serum、1×GS Nucleoside Supplement、1×GlutaMAXTM、1×Anti-anti、0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol、4 ng/mL Human recombinant FGF。培養細胞每2 d半量換液1次，每4～5 d傳代1次。

1. 3 轉染綠色熒光蛋白（GFP）基因及篩選

PiggyBac轉座子內含GFP基因及嘌呤霉素篩選基因。轉染前將PGC轉移到24孔板中，然后按照Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent轉染試劑盒說明進行轉染，轉染6 h后收集細胞，離心，重懸后接種到新的飼養層上，加入新鮮CKO培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。細胞長滿后加入1 μg/mL嘌呤霉素進行篩選，連續篩選3代即獲得穩定表達GFP基因的細胞系。

1. 4 雞胚胚期確定

雞胚分別孵育50、55、60和65 h，沿氣室將氣室鈍端蛋殼揭去，掀去內殼膜，暴露出雞胚。然后用注射器將臺盼藍注射到胚盤下方，體視顯微鏡下觀察雞胚的體節，每個時間組觀察3枚雞胚。

1. 5 PGC移植

雞胚分成4組，分別孵育50、55、60和65 h后進行移植注射。具體操作步驟：收集GFP-PGC離心，重懸，細胞計數，取所需細胞數，加培養液至總體積的90%，然后加入10%臺盼藍，混勻。將孵育到預定時間的雞胚取出，酒精噴灑表面并擦干，照蛋確定氣室，在氣室中間用彎頭鑷子開一個直徑約0.5 cm的小孔，用尖鑷撕開蛋殼膜，暴露出雞胚。用微量注射針吸取細胞，注入雞胚血脈系統中，每枚雞胚注入1萬個細胞。用封口膜封閉，將雞胚放回孵育箱中繼續孵育。

1. 6 解剖雞胚分離性腺

移植注射5 d后取出活胚，用鑷子分離雞胚性腺，置于滴有80 μL PBS的載玻片上，蓋上蓋玻片，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照，統計GFP陽性細胞數或判定性腺中遷移細胞的等級。由于性腺中的GFP陽性細胞數超過500個時，細胞重疊造成計數困難，因此將性腺按照如下規則劃分為6個等級。Ⅵ級：兩條性腺布滿GFP陽性細胞；Ⅴ級：一條性腺全滿，另一條性腺半滿或兩條都是一大半；Ⅳ級：一條性腺全滿，另一條性腺很少或兩條性腺都是半滿；Ⅲ級：一條性腺半滿，另一條性腺很少或兩條性腺加起來超過500個GFP陽性細胞；Ⅱ級：GFP陽性細胞數在200～500個；Ⅰ級：GFP陽性細胞數少于200個。

1. 7 數據處理

以ImageJ 1.45統計細胞數，采用GraphPad Prism v5.0對試驗數據進行處理。

2 結果與分析

2. 1 PGC培養及轉染GFP基因

在經γ射線處理的MEF飼養層上，PGC生長狀況良好，細胞呈圓形、邊緣光亮、體積較大、細胞核大等形態特征。PGC增殖較快，通常能看到兩個連在一起或成串的細胞。用Lipofectamine■ LTX & PLUSTM Reagent轉染PiggyBac轉座子，結果獲得表達綠色熒光蛋白的PGC（稱為GFP-PGC）（圖1），共轉染兩孔，轉染效率分別為5.03%和6.16%。經過3代篩選后，獲得表達GFP的細胞株。

2. 2 雞胚胚齡的確定

于雞胚孵育到相應的時間后打開雞胚，在雞胚胚盤下注射臺盼藍，通過觀察雞胚的體節（圖2）而確定廣西黃羽雞胚孵育時間所對應的胚齡。結果表明，孵育50、55、60、65 h的雞胚分別出現21～22對、24～25對、27～28對和30～32對體節，對應的胚齡為14HH、15HH、16HH和17HH。

2. 3 移植胚齡對雞胚存活率的影響

分別在孵育至14HH、15HH、16HH和17HH時移植PGC，移植5 d后將雞蛋打開，觀察雞胚的死亡情況。結果如圖3所示，雞胚死亡率為30.0%～60.9%，方差分析結果顯示4個移植胚齡間的雞胚死亡率差異不顯著（P>0.05）。

2. 4 PGC的遷移效率

熒光顯微鏡下觀察不同受體胚齡移植GFP-PGC的遷移效率，每組檢測20枚雞胚，共檢測80枚。結果表明，根據雞胚性腺中GFP陽性細胞數可劃分為6個等級（I～VI），且隨著孵育時間的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢（圖4）。14HH移植組雞胚性腺中的GFP陽性細胞集中在V級（40.0%），15HH移植組的集中在III級（42.1%），16HH和17HH移植組則集中在II級（45.4%和54.5%），GFP陽性細胞含量最高等級（VI級）僅出現在14HH移植組（圖5），說明雞胚孵育至14HH時回注PGC的遷移效率最高。

3 討論

轉基因家禽作為發育生物學研究的一個理想生物體模型（Rashidi and Sottile，2009），可用于培育抗病或高生產性能的優良品種家禽及藥用蛋白的生物反應器（Lillico et al.，2005），具有廣泛的應用前景。McGrew等（2004）將重組慢病毒注射到新鮮產下的受精蛋胚盤中，獲得轉基因嵌合體后代。Macdonald等（2012）利用PiggyBac及Tol2轉座子有效轉染PGC后回注到雞胚血脈系統，獲得表達GFP蛋白的轉基因雞。Tyack等（2013）用miniTol2轉座子質粒直接體內轉染PGC獲得穩定的生殖系轉基因公雞，且能將轉基因傳遞給下一代。但這些研究獲得轉基因雞的效率均相對較低，因此有必要進一步提高外源PGC遷移到性腺的效率而提高轉基因嵌合效率。本研究通過系統探究移植時間對PGC遷移效率的影響，結果發現雞胚孵育至50 h（14HH）時移植PGC的遷移效率較孵育至更后期再移植的高，與Nakamura等（2007）研究表明雞PGC于14HH時在血液中達到峰值相符。

根據PGC在雞胚發育不同時期的遷移和分布情況，有關學者已成功從血液、性腺中分離獲得雞PGC （Shiue et al.，2009；Tonus et al.，2014）；但由于PGC在體外易分化，為保持其未分化狀態及生物學特性，通常需要在培養液中添加FGF、LIF、SCF等各種生長因子。本研究以孵育14HH～15HH雞胚血液為分離材料，用MEF飼養層及KO-DMEM培養液進行培養，成功分離獲得雄性PGC細胞系，為后續轉基因研究提供了充足的細胞來源。本研究選用的雞胚孵育50 h為21～22對體節、55 h為24～25對體節、60 h為27～28對體節、65 h為30～32對體節，分別對應14HH、15HH、16HH和17HH，與Hamburger和Hamiltion（1992）、李碧春等（2000）研究觀察到的雞胚發育時期一致。此外，本研究分別統計14HH～17HH雞胚移植PGC后的死亡率，結果表明，移植5 d后雞胚的死亡率為30.0%～60.9%，越早期進行注射移植，雞胚死亡率越高，但差異不顯著。雞胚在整個孵育階段有兩個死亡高峰，一個是在孵育3～5 d，另一個是在18 d以后（薛松磊等，2013）。本研究在雞胚齡14HH～17HH（孵育50～65 h）時進行顯微注射，可能也是造成雞胚死亡增加的一個重要原因。但由于更早期的雞胚血液系統尚未完全發育，注射操作十分困難，因此PGC移植注射的最佳時間窗口為14HH雞胚。

4 結論

隨著受體胚齡的增加，PGC遷移效率呈下降趨勢，但鑒于實際操作的難易程度，確定PGC移植注射的最佳時間窗口為14HH雞胚（孵育50 h）。

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（責任編輯 蘭宗寶）