十大功勞屬6個種的遺傳多樣性及親緣關系RAPD分析

農志歡 張啟偉 楊平 何飛 曾憲彪 蘇華 韋寶偉 唐毓凡 毛長智 韋桂寧

摘要：【目的】分析十大功勞屬6個種的遺傳多樣性及親緣關系，為其資源保護和開發利用提供參考依據。【方法】采集十大功勞屬6個種植物樣品，提取基因組DNA，采用優化的RAPD反應體系和條件進行多態性檢測，分析多態性條帶規律，并用NTSYS-pc Version 2.11a進行數據分析，計算遺傳相似系數，用非加權配對算術平均法（UPGMA）進行聚類分析，生成聚類圖。【結果】十大功勞屬6個種的21條重復性好、穩定性高的有效引物共擴增出264條條帶，其中多態性條帶234條，多態性比例為88.64%，多態性信息含量（PIC）為0.373～0.414；6個種的遺傳相似系數為0.45～0.78。UPGMA聚類分析結果表明，在遺傳相似系數0.53處，6個種可分為3個組，其中闊葉十大功勞M. bealei和小果十大功勞M. bodinieri Gagnep.為一組，靖西全緣葉十大功勞M. jingxiensis為一組，其他3個種為一組；在遺傳相似系數0.59處，細葉十大功勞M. fortunei單獨為一組，長柱十大功勞M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功勞M. subimbricata W. Y. Chun et F. Chun為一組。【結論】十大功勞屬6個種植物具有較豐富的遺傳多樣性，部分種之間有較近的親緣關系。

關鍵詞： 十大功勞；遺傳多樣性；親緣關系；RAPD；聚類分析

中圖分類號： S567.19 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1077-06

0 引言

【研究意義】十大功勞是小檗科十大功勞屬（Mahonia）植物，擁有約60個種，其中在我國發現有35個種，主要分布在廣西、四川、云南及西藏等地（余天虹等，2015）。十大功勞有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，可用于治療濕熱瀉痢、黃疸、目赤腫痛、胃火牙痛、痢疾及黃疸型肝炎等（陳明生等，2014），藥用價值極高，是“功勞去火片”、“婦科千金片”等中藥制劑或中成藥的主要原料（He and Mu，2015），市場需求量越來越大，而目前能用于制藥的十大功勞僅有闊葉十大功勞（Mahonia bealei）或細葉十大功勞（M. fortunei）的干燥莖，其資源極其缺乏，且極少人工大面積種植。因此，研究十大功勞的種質遺傳多樣性，明確不同種十大功勞間的親緣關系，以尋找闊葉十大功勞或細葉十大功勞的替代品，擴大功勞木的藥材來源，對其資源的保護和合理開發利用具有重要意義。【前人研究進展】隨機擴增多態性DNA（Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）是一種以電泳和PCR為核心的分子標記技術（蔣向輝和佘朝文，2011；楊學明等，2011），具有靈敏度高、模板用量少、成本低、獲取信息量大等優點（陳集成等，2014），目前已廣泛應用于動植物資源鑒定、親緣關系分析及遺傳多樣性分析等（張敏瑩等，2013；陳天青等，2015；蘭琴英等，2015）。Esmaeelkhanian等（2007）運用RAPD分析方法對伊朗6個品種山羊的遺傳多樣進行分析，確定其親緣關系，并得到了聚類分析圖。Khan等（2008）研究表明，RAPD分子標記技術能簡單快速地分析野生芥菜（Brassica juncea）的親緣關系和種質遺傳變異情況。朱學峰（2011）提取7只廣西中華草龜的基因組DNA，利用RAPD技術對其遺傳多樣性進行分析，為廣西草龜資源的合理開發利用和保護提供了科學依據。江文等（2012）利用RAPD分子標記技術分析了24個荸薺地方品種的親緣關系及遺傳多樣性，為荸薺品種資源研究和選育提供理論依據。徐婧等（2012）采用單因子試驗和正交設計方法，對闊葉十大功勞ISSR-PCR反應體系進行優化，為探討闊葉十大功勞種質遺傳多樣性打下了基礎。夏葉等（2014）通過ITS2測序建立了十大功勞與其近緣易混品種的鑒別方法。【本研究切入點】目前，國內外關于十大功勞的研究主要集中在藥效方面（Miyasaki et al.，2013；Zhang et al.，2014），針對遺傳多樣性及親緣關系的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】利用RAPD分析方法對6個種十大功勞進行遺傳多樣性及親緣關系分析，為十大功勞藥材資源的保護和開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

十大功勞屬6個種分別為細葉十大功勞M. fortunei、小果十大功勞M. bodinieri Gagnep.（采集于南寧市廣西藥用植物園）、闊葉十大功勞M. bealei（采集于中國科學院廣西植物研究所）、靖西全緣葉十大功勞M. jingxiensis（采集于廣西那坡縣）、長柱十大功勞M. duclouxiana Gagnep.和靖西十大功勞M. subimbricata W.Y. Chun et F. Chun（采集于廣西凌云縣），采集其新鮮葉樣品后迅速用硅膠干燥保存。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物合成與篩選 50條Sangon隨機引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，50條Operons隨機引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。從中篩選出21條能擴增出清晰條帶、重現性好的引物用于RAPD分析。引物序列見表1。

1. 2. 2 DNA提取及檢測 采用DNeasy Plant Mini Kit（德國QIAGEN公司）的方法，嚴格按照試劑盒說明進行DNA提取。采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性，用酶標儀測定260和280 nm下的OD值，檢測DNA的純度和濃度，稀釋成約20.0 ng/μL備用。

1. 2. 3 RAPD反應程序及擴增條件建立 經過反復摸索、正交優化，確定RAPD-PCR反應體系為25.0 μL，其中包括10×Pfu Buffer 2.5 μL（Thermo公司）， MgSO4 2.5 μL（Thermo公司，濃度為25 mmol/L），dNTP 0.5 μL[生工生物工程（上海）股份有限公司，濃度10 mmol/L]， Pfu DNA Polymerase 0.5 μL（Thermo公司，濃度2.5 U/μL），隨機引物1.0 μL，模板1.0 μL和ddH2O 17.0 μL。擴增程序：95.0 ℃預變性4 min；95.0 ℃ 1 min，35.4 ℃ 1 min，72.0 ℃ 2 min，進行40個循環；最后72.0 ℃ 延伸10 min。

RAPD-PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠膠（含Goldview I型核酸染色劑）電泳，電壓80 V，電泳時間40 min。用Gel Doc XR+（Bio-Rad公司）凝膠成像系統進行拍照分析。將電泳圖譜中有清晰條帶且具有重現性的記為1，沒有條帶或重現性不好的記為0，得到由1和0組成的數據矩陣，統計單位引物擴增的總條帶數和多態性條帶數，并計算多態性條帶百分率。

多態性條帶百分率（%）=多態性條帶數/總條帶數×100

1. 3 統計分析

采用NTSYS-pc Version 2.11a進行數據分析，計算6個種間的遺傳相似系數（Genetic similarity coefficient，GSC），用非加權配對算術平均法（Unweighted pair group mean average，UPGMA）進行聚類分析，并生成聚類分析圖。

2 結果與分析

2. 1 DNA提取結果

十大功勞屬6個種葉片樣品提取的DNA經檢測A260/A280為1.7～1.9，說明樣品的DNA純度較高。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果（圖1）顯示，DNA分子量均在20 kb左右，無明顯降解現象。

2. 2 RAPD擴增結果

21條隨機引物共擴增出264條條帶，其中多態性條帶234條，多態性比例為88.64%，表明選取的十大功勞屬6個種具有較豐富的遺傳多樣性。不同引物擴增獲得的DNA條帶數不同，平均每條引物產生12.57條條帶，其中引物OPA9擴增的條帶最多，為21條，引物S99和OPB5最少，僅3條（表1）。這些擴增條帶大小為200～2000 bp。圖2為引物S32和OPB4的RAPD擴增圖譜。

參考Roldán-Ruiz等（2000）的方法分析多態性條帶的分布規律，計算多態性信息含量（Polymorphic information content，PIC）。從圖3可以看出，十大功勞屬6個種的平均PIC為：小果十大功勞0.414，細葉十大功勞0.412，闊葉十大功勞0.407，靖西十大功勞0.398，靖西全緣葉十大功勞0.396，長柱十大功勞0.373。

2. 3 遺傳相似性評價結果

對21條引物擴增得到條帶用NTSYS-pc Version 2.11a計算GSC（表2）。由表2可知，十大功勞屬6個種的GSC為0.45～0.78。其中靖西十大功勞和小果十大功勞的GSC最小，為0.45，說明二者的親緣關系較遠；闊葉十大功勞和小果十大功勞的GSC最大，為0.78，推測二者可能具有共同起源或為近緣品種，擁有相似的藥用成分。

2. 4 聚類分析結果

運用UPGMA法對十大功勞屬6個種的親緣關系進行聚類分析，得到其聚類樹。從圖4可以看出，在GSC為0.53處，6個種可分為3個組：闊葉十大功勞和小果十大功勞為一組，靖西全緣葉十大功勞為一組，其他3個種為一組；在GSC為0.59處，細葉十大功勞單獨為一組，長柱十大功勞和靖西十大功勞為一組。

3 討論

植物DNA的提取要求采用新鮮、低溫冷凍或硅膠干燥保存的樣品，但在遠距離采樣或采樣時受地形環境的限制等很難攜帶用于樣品保鮮的液氮或冰壺，因此，硅膠干燥保存法更加方便實用，且成本較低（李學營等，2006）。本研究曾嘗試用CTAB法及國內幾個試劑盒的方法提取硅膠干燥保存十大功勞屬6個種葉片的基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳并未見DNA條帶，增加水浴時間后，DNA降解十分嚴重，1.0%瓊脂糖凝膠電泳呈現彌散狀態，與韓玉杰等（2008）的研究結果一致，難以提取獲得高質量的DNA。這可能與十大功勞葉片組織含有較多的多糖及酚類、色素等其他次生代謝產物且很難從破碎的植物細胞中抽提出來有關。改用德國QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit方法后，其提取液能充分破碎植物細胞，且采用特制的離心柱法能有效分離多糖及多酚等，最終可得到質量較好的DNA。

一般來說，RAPD擴增產生的每條條帶即代表基因中的一個位點（楊瑞武等，2001）。本研究用21條RAPD引物共擴增出264條條帶，意味著已經對十大功勞屬6個品種基因組的264個位點進行了檢查。264條條帶中只有30條條帶為十大功勞屬6個種所共有，十大功勞屬6個種的PIC為0.373～0.414，說明十大功勞屬6個種存在較豐富的遺傳多樣性。十大功勞屬6個種的GSC為0.45～0.78，其中闊葉十大功勞和小果十大功勞的GSC最大，為0.78，推斷二者可能具有共同起源或為近緣品種，因此，可以考慮將小果十大功勞作為闊葉十大功勞的替代品用作藥材，但其藥效學、毒理學研究還需進一步證實。

以RAPD數據為基礎的聚類分析是植物分類鑒別的重要依據。王艇等（2001）通過RAPD數據分析，構建了小檗屬、十大功勞屬等5個屬6種植物的聚類分析圖，結果顯示闊葉十大功勞是獨立的一個屬，與小檗屬的綠葉小檗、貓兒刺不能聚為一類，說明在小檗科內建立十大功勞屬較合理。本研究中的聚類分析結果顯示，在GSC為0.53時，十大功勞屬6個種可分為3個組：闊葉十大功勞和小果十大功勞為一組，靖西全緣葉十大功勞為一組，其他3個種為一組；當GSC為0.59時，細葉十大功勞單獨為一組，長柱十大功勞和靖西十大功勞為一組。這與對十大功勞的形態學觀察結果（Wu et al.，2009）既有一致性也存在一定差異。闊葉十大功勞和小果十大功勞葉片形態相似，葉緣有粗大的刺鋸齒，二者聚為一組與形態學觀察結果基本相符；靖西全緣葉十大功勞葉片全緣無鋸齒，與其他品種有顯著區別，將其聚為獨立的一組有一定的合理性；長柱十大功勞的花柱長達3 mm，花序長8～30 cm（中國科學院中國植物志編輯委員會，2001），與其他品種有明顯區別，可獨立為一組，將其與靖西十大功勞聚在一起，與形態學觀察結果比較存在一定的偏差。

RAPD分析標記技術存在一些不足，其中最突出的是穩定性較差，本研究通過嚴格控制RAPD-PCR反應酶、模板DNA、dNTP及Mg2+等關鍵因素的質量，經過反復摸索、正交優化，確定RAPD-PCR反應體系和擴增程序對100條隨機引物進行篩選，最終得到較穩定且可重現的分析結果。可見，RAPD分子標記技術能較好地應用于對十大功勞植物遺傳多樣性和親緣關系的分析。

4 結論

十大功勞屬6個種植物具有較豐富的遺傳多樣性，部分種之間親緣關系較近，可作為今后開展人工選育優質十大功勞藥材研究的參考依據。

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（責任編輯 思利華）