小麥新種質P13的抗條銹性鑒定及抗病機制研究

熊仕俊 黃芳 孫翠英 梁傳靜 蔣選利

摘要：【目的】探索小麥新種質P13對條銹病的抗病性及其抗性機制，為P13種質的進一步推廣利用提供理論依據。【方法】以銘賢169為感病對照，用6個條銹菌生理小種（CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和Hybrid46-8）對P13進行苗期抗條銹性鑒定；采用自然誘發法鑒定P13的田間抗條銹性；以P13和銘賢169為材料，采用常規的夏孢子懸浮液涂抹法接種條銹菌CYR29，以不接種為對照，然后測定多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶等抗病相關酶活性。【結果】苗期P13對CYR32表現為免疫，對CYR29、CYR33和Hybrid46-8表現為近免疫，對CYR23表現為高抗，對CYR31表現為感病。P13在拔節期、孕穗期和乳熟期均表現為免疫或近免疫。P13接種條銹病菌CYR29后，其葉片內 POD、PAL、PPO、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶的活性均高于未接種植株和感病對照銘賢169。【結論】P13對貴州小麥條銹菌生理小種表現出較強的抗病性，其在貴州小麥生產及抗病育種方面具有極高的應用價值。

關鍵詞： 小麥；P13；條銹病；抗病性；鑒定

中圖分類號： S435.121.12 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）06-0934-07

0 引言

【研究意義】小麥條銹病（Wheat stripe rust or yellow rust）是由小麥條銹菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）侵染引起的氣傳小麥葉部病害。我國是世界上小麥條銹病最大的流行區域，歷史上小麥條銹病4次（1950、1964、1990和2002年）大流行均導致1.0×106 t以上的產量損失，損失小麥產量總計約1.2×107 t（康振生等，2015）。小麥條銹病是全球小麥生產上的重大病害，是各小麥主產國最具威脅性的生物災害，實踐證明，選育和種植抗病品種是防治該病最經濟、有效且對環境安全的方法（馬東方等，2015）。小麥新種質P13是小麥育種專家張慶勤教授利用硬粒小麥與偏凸山羊草雜交育成，具有抗旱、抗寒、優質等特點，是重要的小麥野生近緣屬種質。目前對P13的抗病機制研究和進一步推廣利用尚未完善，因此，加強對P13抗條銹病的機制和特點進行研究，對于小麥抗條銹病育種和控制小麥條銹病流行具有重要意義。【前人研究進展】偏凸山羊草（Aegilops ventricosa，DDMVMV，2n=28）是小麥亞族山羊草屬中的一種草本植物（戴秀梅和張慶勤，1997；張衛兵等，1998），研究發現其具有耐鹽、抗寒，對小麥白粉病、銹病等高抗或免疫等優良性狀。抗條銹病基因Yr17（Robert et al.，2000）和YrG775（張超等，2006）來源于偏凸山羊草。肖建富和丁守仁（1998）研究表明，硬粒小麥具有矮稈、多抗和千粒重高等特點，且易傳遞給雜種后代，常被用作小麥育種的親本。植物體內廣泛存在多種與植物抗病性相關的防衛酶，其活性是植物抗病性的重要指標（Bolton et al.，2008）。張建軍等（1996）研究表明，小麥品種接種梭條斑花葉病毒后各品種的多酚氧化酶（PPO）活性均高于未接種對照，且抗病品種的升高幅度顯著大于感病品種，同時在未接種處理中，抗梭條斑花葉病毒病的小麥品種其PPO活性高于感病品種。蔣選利（2002）采用細胞化學方法對條銹菌侵染小麥過程中過氧化物酶（POD）的分布及其活性進行了研究，結果顯示，大部分POD分布在細胞壁和細胞間隙；未接種對照，抗、感品種的POD活性均較低；接種條銹菌后，抗、感病品種的葉內POD活性均升高，且抗病品種明顯大于感病品種。魏相峰和湯會君（2006）研究表明，煙草的苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性與抗野火病表現呈正相關，抗、感品種的PAL活性差異顯著。李春娟等（2004）研究表明，真菌菌絲的生長會受到幾丁質酶的抑制，使真菌頂端細胞壁變薄，其結果是原生質膜破裂，從而達到抗病的目的。【本研究切入點】目前對P13的抗病機制研究尚不完善，該種質對哪些條銹菌生理小種具有抗性也未見報道，進而限制了P13在抗病育種和生產中的應用。【擬解決的關鍵問題】對P13苗期和田間生長期抗條銹性進行鑒定，并測定1葉期P13接種條銹菌生理小種CYR29后葉片中POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶等酶活性變化，研究其抗條銹病機制，為P13種質的進一步合理推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

植物材料：小麥抗源材料P13由貴州大學張慶勤教授提供；感病品種銘賢169由貴州省農業科學院旱糧研究所提供。

供試菌種：苗期所用條銹菌系為CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和Hybrid46-8等6個條銹菌生理小種，由西北農林科技大學植物病理研究所提供，均在銘賢169上隔離繁殖后收集其夏孢子備用。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 苗期抗病性鑒定 苗期抗病性鑒定參照王寧（2012）的方法，分別用菌種CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和Hybrid46-8對P13進行苗期抗條銹性鑒定，以銘賢169為感病對照，重復3次。接種后第15 d進行抗病性調查，供試材料對條銹菌的抗病性以反應型表示，反應型按0、0；、1、2、3、4六級標準調查記載（李振岐和曾士邁，2002）。

1. 2. 2 田間抗病性鑒定

1. 2. 2. 1 試驗地點 試驗病圃設在貴州省貴陽市和赫章縣。貴陽市全年氣候溫暖濕潤，小麥條銹病菌能大范圍生長和繁殖。小麥是貴州省赫章縣的主要糧食作物，多年來小麥條銹病發生頻率較高，是貴州省小麥條銹病重發區。

1. 2. 2. 2 抗病性鑒定方法 2012年小麥生長季，采用自然誘發法對P13進行抗條銹性鑒定。試驗設計：在病圃內分設6個小區，每小區面積25.0 m2；每小區按行播種小麥，每8行P13交替種植1行銘賢169，每行160粒種子，行長2.3 m，行距0.3 m；在小區兩端和整個病圃的四周均種植1行銘賢169作為感病對照和自然病圃的誘發行，以確保發病充分。根據當地正常播種時間進行播種。分別在小麥拔節期、孕穗期和乳熟期進行抗條銹性調查。

參照《小麥抗病蟲性評價技術規范》（NY/T 1443.1-2007）（中華人民共和國農業部，2007）對P13受小麥條銹菌侵染后的普遍率、嚴重度、反應型等進行調查。品種的抗病性用反應型表示，反應型分級標準與苗期抗病性鑒定相同。

1. 2. 3 P13種質抗病相關酶活性測定 （1）接種：將飽滿度一致的P13和銘賢169種子播于直徑9 cm的花盆內，溫室培養，待發育至1葉期供試驗用。（2）酶活性測定：將1葉期P13和銘賢169各分為兩組，每組約40株苗，一組采用常規的夏孢子懸浮液涂抹法（王寧，2012）接種CYR29，另一組不接種作為對照。同時黑暗保濕24 h后，取出在溫室繼續培養。分別在接種后1、2、3、4、5和7 d同一時間取樣測定小麥葉片內POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶等抗病相關酶活性。

POD活性測定采用Ye等（1990）的方法；PPO活性測定參照朱廣廉等（1990）的方法；PAL活性測定參照郭文碩（2002）的方法；β-1，3-葡聚糖酶活性測定參照Joosten和De Wit（1989）的方法；幾丁質酶活性測定參照徐恩靜（2011）的方法。

2 結果與分析

2. 1 P13苗期抗病性鑒定結果

鑒定結果（表1）顯示，P13對CYR32表現為免疫（反應型0），對CYR29、CYR33和Hybrid46-8表現為近免疫（反應型0；），對CYR23表現為高抗（反應型1），對CYR31表現為感病（反應型3）。銘賢169均表現為高感（反應型4）。

2. 2 P13田間抗病性鑒定結果

貴陽點田間抗病性鑒定結果：P13在拔節期表現為免疫（反應型0），孕穗期至乳熟期表現為近免疫（表現型0；）；赫章點田間抗病性鑒定結果：P13在拔節期至孕穗期表現為免疫（反應型0），乳熟期表現為近免疫（反應型0；）。銘賢169均表現為感病（反應型3～4）。

2. 3 P13種質抗病相關酶活性測定結果

2. 3. 1 POD活性變化 由圖1可知，接種CYR29后，P13和銘賢169的POD活性整體上表現為先升后降趨勢。接種后的P13葉片POD活性高于未接種處理，其葉片POD活性在第4 d達到峰值，為1.50 U/gFW，是未接種處理的142.29%，隨后二者的酶活性均下降，但兩者的POD活性始終高于銘賢169。接種CYR29后，銘賢169葉片POD活性也在第4 d達到較高水平，為1.05 U/gFW，而其未接種處理為0.97 U/gFW，隨后二者的酶活性也逐漸下降。可見，P13和銘賢169接種CYR29后的植株葉片POD活性均高于其未接種植株，且P13的POD活性高于銘賢169，二者峰值出現的時間基本一致。

2. 3. 2 PAL活性變化 由圖2可知，P13接種CYR29及未接種處理葉片PAL活性變化趨勢基本一致，峰值均出現在接種后第3 d，接種處理為401.50 U/gFW，未接種處理為388.50 U/gFW，隨后均下降并趨于平穩。銘賢169接種CYR29后葉片PAL活性在第3 d達到峰值，為296.25 U/gFW，而未接種處理的PAL活性變化平穩，無明顯峰值。可見，在苗期接種CYR29后，P13和銘賢169的葉片PAL活性均比未接種處理略有升高，且P13的PAL活性高于銘賢169。

2. 3. 3 PPO活性變化 由圖3可知，接種CYR29后，P13的PPO活性在1～2 d時低于未接種處理，但在3～7 d時高于未接種處理，且在第5 d達到峰值（47.00 U/gFW），為對照的122.08%，第7 d后葉片出現花斑，酶活性下降。感病對照銘賢169接種CYR29后1～2 d時PPO活性急劇上升，3～4 d時接種與未接種處理的PPO活性幾乎保持一致，在第5 d時達到較高水平，為30.00 U/g FW，未接種處理為27.00 U/gFW。可見，P13葉片的PPO活性峰值出現時間較晚，但均高于銘賢169。

2. 3. 4 β-1，3-葡聚糖酶活性變化 由圖4可知，P13和銘賢169的葉片β-1，3-葡聚糖酶活性均呈先升后降趨勢。接種CYR29后，P13葉片β-1，3-葡聚糖酶活性與未接種處理在第1 d時保持一致，隨后接種處理的β-1，3-葡聚糖酶活性升高，于第3 d達到峰值，為646.75 U/gFW，是未接種處理的106.80%，隨后二者的β-1，3-葡聚糖酶活性均開始下降。銘賢169接種CYR29后其葉片β-1，3-葡聚糖酶活性變化幅度較大，接種后第3 d達到較高水平，隨后急劇下降，第7 d出現花斑，酶活性降至最低；未接種處理的β-1，3-葡聚糖酶活性變化不明顯，無明顯峰值出現。可見，P13無論接種還是未接種CYR29，其葉片β-1，3-葡聚糖酶活性均高于銘賢169。

2. 3. 5 幾丁質酶活性的變化 由圖5可知，P13葉片的幾丁質酶活性在接種CYR29后1～2 d均高于未接種處理，并在第2 d達到峰值（12.50 U/gFW），是未接種處理的156.25%，隨后逐漸下降，到第5 d開始上升并趨于穩定；P13未接種處理與接種處理變化趨勢相同，但其葉片幾丁質酶活性均低于接種處理。銘賢169在接種CYR29后1 d時幾丁質酶活性高于未接種處理，第2 d達較高水平，而未接種處理的幾丁質酶活性幾乎無變化。可見，接種病原菌后，P13和銘賢169的葉片幾丁質酶活性均表現出穩定而持續的高量表達，且P13葉片的幾丁質酶活性高于銘賢169。

3 討論

3. 1 P13種質苗期抗病性

本研究采用小麥條銹菌6個生理小種CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33和Hybrid46-8對P13苗期進行抗條銹性鑒定，其中，CYR32和CYR33為我國當前主要的小麥條銹菌生理小種，二者流行頻率之和大于50%；CYR23、CYR29和CYR31為我國近年主要小麥條銹菌生理小種，目前流行頻率均小于10%（王保通，2007）；CYR32和CYR31是導致貴州省小麥條銹病的主要生理小種，出現頻率較高（李星星，2009）；Hybrid46-8是Hybrid46類群的重要組成小種，而Hybrid46類群是我國目前的主要流行小種，其變化態勢穩定，在我國各地均有一定的流行趨勢（王保通，2007）。因此，供試6個小麥條銹菌生理小種均是引發貴州小麥條銹病的主要生理小種。本研究鑒定結果表明，除CYR31小種外，P13對其余5個小麥條銹菌生理小種均具有很強的抗病性，說明P13的抗條銹性為小種專化抗病性。由于P13對我國小麥條銹病優勢小種依然表現出很強的抗病性，因此P13對控制我國小麥條銹病具有重要作用。

3. 2 P13種質田間生長期抗病性

貴陽地處云貴高原東部，具有獨特的山地氣候條件，全年溫度不低于-5 ℃，且濕度較大，使得小麥條銹病菌大量生長和繁殖，因此多年來小麥條銹病在貴陽嚴重發生。貴州省赫章縣常年小麥播種面積0.93萬ha，小麥是該縣主要的糧食作物，近年來赫章縣小麥條銹病發生嚴重，小麥大幅減產，部分鄉鎮甚至絕收。本研究的田間抗病性鑒定地點為貴州省赫章縣六曲河鎮，其海拔在1800 m左右，王海光等（2007）調查研究表明，赫章縣在海拔1660～1910 m有小麥條銹病發生，且條銹菌能順利越夏，當地環境中的菌量充足使得該地小麥秋苗發病嚴重。在這種高病害選擇壓力下，所培育種植的小麥品種必然具備較強的抗條銹性。

貴陽適宜的天氣及赫章縣越夏菌源使麥區環境中的小麥條銹菌充足，為本研究的田間抗病性鑒定提供了可靠保障。本研究鑒定結果表明，P13無論在貴陽市還是在小麥條銹病發生較重的赫章縣，從拔節期到乳熟期均表現為免疫或近免疫（反應型0～0；），銘賢169表現為感病反應（反應型3～4）。目前，在貴州廣泛推廣種植的貴農21（程穎等，2006）、貴農6（劉利利等，2009）、貴農22（李強等，2011）、貴農775（王寧，2012）等貴農系列品種曾表現良好抗性（反應型0～0；），但在該次田間抗病性鑒定中表現為中抗至高感（反應型2～4），說明貴州當地小麥條銹菌的生理小種已發生變化，使貴農21、貴農6、貴農22、貴農775等貴農系列品種喪失抗條銹性，而P13對貴州小麥條銹菌生理小種表現出很強抗病性，其在貴州小麥生產及抗病育種方面具有極高的應用價值。

3. 3 P13種質的抗病性機制

POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶是主要的抗病相關酶，其在小麥種質中的活性是小麥抗病性的重要指標。POD是活性氧代謝過程中主要的酶，在細胞壁中的POD可催化還原型輔酶Ⅰ（NADH）或還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化產生O2-，O2-進一步歧化為H2O2和分子氧，H2O2對真菌孢子萌發具有直接抑制作用，而且能誘導一系列的防衛反應。PAL是一種誘導酶，高活性的PAL能促進木質素積累、酚類物質和植保素合成（江昌俊和余有本，2001）。PPO是酚類物質合成木質素的重要催化劑，能促進細胞壁木質化從而抵抗病原菌的侵染（Mayer，1979）。杜良成和王鈞（1992）研究表明，稻瘟病菌（Pyricularia oryzae C.）侵染水稻后，可誘導水稻中的幾丁質酶和β-1，3-葡聚糖酶的酶活力分別提高6～9倍和3～5倍，是植物抵抗病原真菌侵害的重要防衛反應之一。幾丁質是大部分真菌細胞壁的主要成分之一，蔣選利（2002）對小麥與條銹菌的互作研究結果顯示，無論是抗病品種還是感病品種，其健康植株的葉內幾丁質酶活性均較低，當條銹菌侵染后，抗感品種的幾丁質酶的活性均升高，且感病品種升高幅度低于抗病品種。

小麥條銹菌條中29號（CYR29，CYR=Chinese Yellow Rust）是近年來貴州小麥條銹菌的主要生理小種（李星星，2009）。本研究結果表明，P13接種CYR29后，其葉片中5種酶（POD、PPO、PAL、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶）的活性均高于感病對照銘賢169，P13和銘賢169的5種酶活性峰值出現的時間基本一致，且P13的5種酶活性水平均高于感病對照，5種酶活性的表達與小麥條銹病抗性呈正相關。用病原菌CYR29接種處理P13后，5種酶的活性均高于未接種處理，表明酶活性增加是P13抗病基因表達的結果。這些高活性的植物防御酶可能正是P13抗條銹病的生化機制。

我國特殊的地理條件導致小麥條銹菌頻繁變異，使目前推廣種植的抗病品種喪失抗病性，全國范圍被迫進行了7次小麥品種更換（Wan et al.，2007）。新小麥種質P13農藝性狀及產量性狀較好，其母本偏凸山羊草蘊藏著豐富的抗條銹病基因（Yr17、YrG775），P13對貴州小麥條銹菌生理小種均表現出很強的抗病性，其抗條銹病基因有待進一步開發利用，對拓寬小麥抗病基因來源及推廣具有持久抗條銹性的小麥種質具有重要意義。

4 結論

本研究結果表明，P13對貴州小麥條銹菌生理小種表現出較強的抗病性，其在貴州小麥生產及抗病育種方面具有極高的應用價值。

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（責任編輯 溫國泉）