巴西橡膠樹乳管細胞HblMYC3互作蛋白篩選與功能分析

王靖　鄧小敏　田維敏

摘 要 MYC是bHLH轉錄因子家族的亞家族成員，在植物茉莉酸信號轉導過程中發揮著重要的調節作用。HblMYC3是從巴西橡膠樹的乳管細胞中分離鑒定到的MYC類轉錄因子，其基因表達受割膠和茉莉酸上調。采用酵母雙雜交方法初步篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在進一步了解HblMYC3的功能。結果表明：HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧還蛋白2、含A20和 AN1 鋅指結構域的脅迫相關蛋白5、28 ku熱和酸穩定的磷蛋白以及25 ku泛素連接酶E2等7種蛋白不同程度地與HblMYC3蛋白互作。基于這些互作蛋白的功能，推測HblMYC1或HblMYC2通過與HblMYC3形成二聚體對小橡膠粒子膜蛋白基因表達進行調控，其他蛋白參與脅迫條件下維持二聚體的穩定性和脅迫反應后降解該二聚體。

關鍵詞 巴西橡膠樹；HblMYC3基因；酵母雙雜交；蛋白相互作用

中圖分類號 S794.1 文獻標示碼 A

Abstract MYC transcription factors are the members of bHLH-type transcription factor superfamily and play an important role in jasmonate signaling transduction. Available data show that HblMYC3 gene is a typical MYC transcriptional factor gene and its transcripts are both enriched in laticifer cells and induced by tapping and exogenous JA. For further revealing its biological functions in laticifer cells， the yeast two-hybridization method was applied to screen candidate interacting partners of the HblMYC3. The results showed that HblMYC1， HblMYC2， DNAJ， glutaredoxin2， zinc finger A20 and AN1 domain-containing stress-associated protein 5， 28 ku heat- and acid-stable phosphoprotein and a 25 ku ubiquitin-conjugating enzyme E2 were detected to interact with HblMYC3 to varying degrees. Based on the reported functions of these candidate parterners， HblMYC1 or HblMYC2 may participate in the regulation of HblMYC3 on the SRPP gene expression in a dimer form， while the others contribute to the stability of the dimer during functioning and thereafter the digestion of the dimer through ubiquitin-mediated proteolysis.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.；HblMYC3 gene；Yeast two-hybridization；Protein interaction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.07.012

植物bHLH類（basic helix-loop-helix）轉錄因子家族是植物中最大的轉錄因子家族之一，參與植物的生長發育、逆境響應和次生代謝調控等生物學過程[1]。在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）、煙草（Nicotiana tabacum L.）和水稻（Oryza sativa L.）中已分離鑒定出各種類型的bHLH類亞家族成員[2]。其中MYC亞家族成員，其N端含有典型的MYC結構域，能夠和CACGTG或CATGTG 特征的 E-box（CANNTG）又稱為（MYC consensus motif）結合，在植物茉莉酸信號轉導和次生代謝中發揮著十分重要的調節作用[3]。

已有研究結果表明，MYC類轉錄因子是茉莉酸信號傳導的關鍵組分之一[4-5]。擬南芥中AtMYC2/3/4類轉錄因子參與調控擬南芥表皮毛的發育、傷害反應和對蟲害的防御及次生代謝物質合成[6]，表明MYC類轉錄因子是重要的逆境響應調節因子，同時具有調控次生代謝物合成的功能。本實驗室前期從橡膠樹乳管細胞的膠乳中分離到若干MYC類轉錄因子基因。如HblMYC1、HblMYC2、HblMYC3、HblMYC4和HblMYC5基因等。這些基因對割膠、茉莉酸和乙烯處理反應模式不盡相同，既表現出冗余性又有獨特的表達模式。其中HblMYC3基因能夠直接結合橡膠合成相關基因HbSRPP上游啟動子區，調控該基因的表達，并且HblMYC3基因受割膠、茉莉酸和乙烯誘導表達[7]。同時發現HblMYC3基因在成齡高產品種中的表達量顯著地高于低產種質[8]，這表明HblMYC3基因與橡膠產量相關。因此，研究HblMYC3基因參與對橡膠生物合成調控的分子機制具有重要的理論意義和實際應用價值。

目前除了包杰[9]發現HblMYC3蛋白能夠與HblMYC1蛋白互作外，還未見利用酵母雙雜交技術高通量篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白報道。因此本研究擬通過酵母雙雜交技術，初步篩選與HblMYC3蛋白互作的蛋白，為進一步研究茉莉酸信號途徑的調控機制奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

膠乳總RNA提取試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自于天根生化科技（北京）有限公司；cDNA反轉錄試劑盒、快速限制性內切酶購自于Thermo ScientificTM公司；PCR克隆所需試劑2x PrimeSTAR Max premix、膠回收試劑盒購自于寶生物工程大連有限公司；克隆載體pEASY-Blunt、大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞購自于北京全式金生物技術有限公司；T4 DNA連接酶購自NEB（北京）公司；酵母雙雜交cDNA文庫構建試劑盒、酵母雙雜交實驗所用pGBKT7和pGADT7載體、Y2HGold酵母菌株及酵母質粒提取試劑盒購自于Clontech公司。

1.2 方法

1.2.1 構建酵母雙雜交pGBKT7-HblMYC3誘餌表達載體 根據NCBI數據庫中HblMYC3基因（GenBank：HM347338）的編碼框序列設計分別帶有SfiⅠ和XmaⅠ酶切位點的載體構建引物：SfiⅠ-HblMYC3-S：5′-CGGCCATGGAGGCCATGGAGGAG

ATAACGTCCCC-3，XmaⅠ-HblMYC3-A：5′-TCCCCGGGTCATAGGCTAGCAGCTAAGTTCTG-3′。載體構建所需模板來自于橡膠樹膠乳RNA反轉錄合成的cDNA，其提取和合成參照試劑盒中的標準方法。PCR反應體系為：總體積20 μL，其中水 8 μL，2×PrimerSTAR Max permix 10 μL，正反向引物（10 μm/L）各0.5 μL， cDNA模板1 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個循環。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后切取正確條帶回收。純化的PCR回收產物與載體pEASY-Blunt在25 ℃連接20 min后，轉化50 μL Trans1-T1感受態細胞涂氨芐抗性平板置于37 ℃孵育過夜。利用載體通用引物M13F和M13R，通過RT-PCR反應鑒定陽性克隆，送英駿公司測序鑒定正確后，提取pEASY-HblMYC3質粒，用SfiⅠ和XmaⅠ進行雙酶切，反應體系為：總體積20 μL，其中水12 μL，pEASY-HblMYC3或pGBKT7質粒4 μL，l0×digestion buffer 2 μL，SfiⅠ1 μL，XmaⅠ1 μL，37 ℃酶切反應1 h。回收純化正確條帶，然后將膠回收片段SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ和酶切過的載體pGBKT7按照如下體系連接：水1 μL，SfiⅠ-HblMYC3-XmaⅠ4 μL，pGBKT7 3 μL，10×T4 DNA ligase buffer 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，16 ℃連接過夜。連接產物轉化參照前述方法進行。用載體構建基因引物檢測陽性克隆菌后，提取質粒pGBKT7-HblMYC3，雙酶切鑒定插入片段大小，并送英俊公司測序鑒定。

1.2.2 pGBKT7-HblMYC3誘餌表達載體轉化Y2HGold酵母菌 酵母感受態細胞的制備和轉化主要參考訾亮等[10]的方法。

1.2.3 重組質粒pGBKT7-HblMYC3自激活作用驗證 將含有重組質粒pGBKT7-HblMYC3的陽性酵母菌和對照酵母菌分別接種于20 mL的SD/-Trp液體培養基中培養過夜，檢測菌體濃度后統一調OD600至0.6左右，然后取4 μL 菌液分別滴加到SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade（添加顯色劑）的缺陷型平板上，30 ℃生長3～6 d后記錄其生長情況。同時為了確定后續酵母雙雜交實驗條件，本研究將空pGADT7-AD載體和pGBKT7-HblMYC3一起轉化Y2HGold酵母菌株，然后涂布SD/-Trp-Leu平板，參照上述自激活檢測方法將酵母菌點至SD/-Leu-Trp和SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加生長抑制劑3-AT）平板上，記錄其生長情況。

1.2.4 酵母雙雜交cDNA文庫構建 酵母雙雜交cDNA文庫構建采用Clontech公司的酵母雙雜交cDNA文庫試劑盒，參照PT4085-1說明書中的方法進行。橡膠樹膠乳材料采集于中國熱帶農業科學院儋州院區試驗場種植的成年割膠樹熱研7-33-97。首先利用天根生化科技（北京）有限公司的植物RNA提取試劑盒提取膠乳樣品的總RNA后，取2 μL RNA樣品，1 μL CDSIII （Oligo-dT）引物和1 μL水置于72 ℃反應2 min，然后置于冰上冷卻，再利用SMART MMLV Reverse Transcriptase合成cDNA第一鏈（反應體系為2 μL 5×First-Strand Buffer，1 μL DTT，1 μL dNTPs ，1 μL SMART MMLV Reverse Transcriptase，置于42 ℃反應10 min后，接著添加1 μL SMART III-modified oligo置于42 ℃反應60 min，75 ℃保溫2 min以終止第一鏈反應，冷卻至室溫后，加入1 μL RNase H置于37 ℃反應20 min。取2 μL First-stand SMART cDNA，70 μL ddH2O，10 μL 10 ×Advantage 2 PCR buffer，2 μL 50×dNTP Mix，2 μL 3′PCR primer，2 μL 5′PCR primer，10 μL Melting Solution， 2 μL 50× Advantage 2 polymerase Mix共100 μL體系按照95 ℃ 30 s，20個循環（95 ℃ 10 s，68 ℃ for 6 min，其中68 ℃延伸時間為每個循環增加5 s），68 ℃ for 5 min后得到雙鏈cDNA，經過Clontech公司的Clontech CHROMA SPINTM TE-400 COLUMN柱子純化后溶于20 μL ddH2O中待用。然后將20 μL ds cDNA和6 μL 線性化的pGADT7-Rec載體利用LiAc轉化法轉入Y187酵母菌株中，涂布于SD/-Leu平板上，于30 ℃培養3～4 d，用5 mL Freezing Medium充分重選每個SD/-Leu平板上的酵母菌，匯集所有酵母菌液后，利用Clontech公司的酵母質粒提取試劑盒提取質粒備用。

1.2.5 文庫篩選和酵母雙雜交陽性克隆的鑒定

在分析評價誘餌質粒的自激活作用后，將誘餌載體pGBKT7-HblMYC3用于酵母雙雜交文庫篩選實驗，方法參照MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System（PT4084-1）。將在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上長出來的菌斑重新挑至新鮮的SD/-Trp-Leu-His-Ade（添加顯色劑）平板上繼續篩選，能連續生長的菌即為候選的陽性克隆菌，提取質粒后轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，涂布氨芐抗性平板后得到陽性菌落，提取質粒后經載體測序引物T7和3′AD（Clontech公司）檢測后，送至測序公司測序，測序結果在NCBI公共數據庫中同源比對獲取相應候選基因的注釋信息。

2 結果與分析

2.1 重組pGBKT7-HblMYC3誘餌表達載體構建與驗證

以橡膠樹膠乳cDNA為模板，通過RT-PCR方法擴增HblMYC3基因的1 450 bp大小的編碼框（圖1-A）。擴增片段經膠回收純化后，與pEASY-Blunt載體連接，通過載體引物PCR篩選陽性克隆菌落，并檢測質粒大小。用SfiⅠ和XmaⅠ雙酶切含有目的片段的質粒，回收目的片段（圖1-A）。將目的片段與pGBKT7載體連接，構建pGBKT7-HblMYC3重組載體，經pGBKT7載體通用引物PCR檢測和雙酶切驗證，插入片段大小與預期大小一致（圖1-B）。進一步通過測序驗證插入目的片段的序列及其翻譯產生的蛋白序列的正確性。把pGBKT7-HblMYC3誘餌表達載體轉入Y2HGold酵母菌中，經pGBKT7載體通用引物PCR篩選陽性菌落（圖1-C）。

2.2 pGBKT7-HblMYC3重組質粒自激活檢測

含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌和含有空載體的酵母菌在SD/-Trp篩選平板上均能生長，而且除了陽性對照菌能夠在SD/-Trp-His-Ade篩選平板上很好的生長外，陰性對照菌不能在該篩選平板上良好生長，含有pGBKT7-HblMYC3的酵母菌生長較慢，菌落很小，這些結果表明pGBKT7-HblMYC3重組質粒自激活很弱，通過控制篩選條件可用于后續文庫篩選（圖2）。通過在SD/-Trp-His-Ade篩選平板上添加1mmol/L 3-AT生長抑制劑能夠抑制pGBKT7-HblMYC3的酵母菌的背景生長，而陽性對照菌仍能正常良好生長（圖2）。由此確定后續HblMYC3蛋白的酵母文庫篩選的條件：SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT （1 mmol/L）。

2.3 陽性克隆的篩選和測序分析

經過在SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上篩選得到了7個酵母菌株。這些候選的酵母菌株接種到SD/-Trp-Leu和添加顯色劑的SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT缺陷型平板上的生長情況見圖3。這些陽性酵母菌都能不同程度地在篩選平板上生長，同時其生長情況和顯色程度的差異可能體現了候選蛋白與靶蛋白HblMYC3之間不同強度的結合能力。陽性酵母菌中的質粒經過測序后，在NCBI數據庫中同源比對分析，結果表明候選蛋白分別為DNAJ分子伴侶/蛋白、參與活性氧清除的glutaredoxin2蛋白、轉錄因子LMYC1和LMYC2、ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白酶體相關蛋白，含zinc finger A20 and AN1 domain的脅迫相關蛋白、參與細胞增殖和信號傳導的28 ku熱、酸穩定磷蛋白（表1）。

3 討論與結論

橡膠樹乳管是一種功能特化的組織，其主要功能是合成天然橡膠。天然橡膠主要在膠乳中的小橡膠粒子上合成[11]，而SRPP蛋白是小橡膠粒子中含量最豐富的蛋白[12]，參與了天然橡膠合成的調節。HblMYC3是從巴西橡膠樹的乳管細胞中分離鑒定到的MYC類轉錄因子，其基因表達受割膠和茉莉酸上調。HblMYC3轉錄因子是SRPP基因表達的上游調控因子，它能直接結合SRPP基因的啟動子，上調SRPP基因的表達[7]。因此推測HblMYC3基因是重要的參與橡膠生物合成調節的因子。本研究采用酵母雙雜交方法初步篩選HblMYC3蛋白的互作蛋白，旨在進一步了解HblMYC3的功能。酵母雙雜交技術是比較成熟和經典的篩選靶蛋白的互作蛋白的方法，已經成功應用于橡膠樹分子生物學的研究中。例如，鄧治等[13]和楊子平等[14]分別利用該方法篩選到膠乳中與轉錄因子HbMyb1蛋白、HbRZF蛋白的互作蛋白；曾日中等[15]利用該方法篩選到膠乳中REF蛋白的互作蛋白。本研究利用酵母雙雜交技術篩選到HblMYC1、HblMYC2、DNAJ 蛋白、谷氧還蛋白2、含A20和 AN1 鋅指結構域的脅迫相關蛋白5、28 ku熱、酸穩定的磷蛋白以及25 ku泛素連接酶E2等7種蛋白，它們不同程度地與HblMYC3蛋白互作，推測HblMYC3可能與這些蛋白在膠乳中形成不同的復合體，參與不同的生物學過程。

DNAJ蛋白是重要的分子伴侶蛋白，對靶蛋白起保護作用，參與了植物對各種逆境脅迫的反應[16-17]。橡膠生產中通過割膠收集膠乳，而割膠對橡膠樹而言是一種傷害脅迫。HblMYC3能夠被割膠處理誘導表達，表明HblMYC3參與了對這一逆境脅迫的反應，而橡膠樹DNAJ蛋白能夠與HblMYC3蛋白互作，可能對保護HblMYC3蛋白有一定作用。

另外篩選到2個已經報道的橡膠樹膠乳轉錄因子HblMYC1（或LMYC1）和HblMYC2（或LMYC2）。HblMYC1和HblMYC2基因與HblMYC3基因同屬于MYC亞類轉錄因子成員[7]。它們能夠被割膠脅迫和茉莉酸誘導表達[18]，但兩者的表達模式相反。HblMYC1和HblMYC2基因不能夠直接結合SRPP基因的上游啟動子（1 103 bp）[7]。因此，HblMYC1或HblMYC2蛋白可能通過與HblMYC3蛋白形成異源二聚體轉錄因子復合體參與調控SRPP基因的表達。本實驗室曾利用點對點酵母雙雜交證明HblMYC3蛋白與HblMYC1蛋白的相互作用[9]。

Glutaredoxin為谷氧還蛋白，參與活性氧的清除，其作用與硫氧還蛋白（Thioredoxin）類似[19]。HblMYC3與glutaredoxin蛋白之間的相互作用可能暗示HblMYC3蛋白參與了膠乳中的抗氧化過程。同時HblMYC3與ubiquitin-conjugating enzyme E2-25 ku蛋白之間的相互作用表明HblMYC3蛋白同樣經由泛素連接酶E2介導的泛素化降解過程。

基于這些互作蛋白的功能，推測HblMYC1或HblMYC2通過與HblMYC3形成二聚體調控小橡膠粒子膜蛋白基因表達，其他蛋白參與脅迫條件下維持該二聚體的穩定性和脅迫反應后降解該蛋白。

參考文獻

[1] 劉曉月， 王文生， 傅彬英. 植物bHLH轉錄因子家族的功能研究進展[J]. 生物技術進展， 2011， 1（6）： 391-397.

[2] 劉文文， 李文學.植物bHLH轉錄因子研究進展[J]. 生物技術進展， 2013， 3（1）： 7-11.

[3] 張 鑫， 宋經元， 胡鳶雷， 等. bHLH轉錄因子調控植物活性成分生物合成的研究進展[J]. 藥學學報， 2014， 49（4）： 435-442.

[4] Boter M， Ruíz-Rivero O， Abdeen A， et al. Conserved MYC transcription factors play a key role in jasmonate signaling both in tomato and Arabidopsis[J]. Genes & Development，2004， 18（13）： 1 577-1 597.

[5] 沈 乾， 陸 續， 張 凌， 等. 植物中MYC2轉錄因子功能研究進展[J]. 上海交通大學學報（農業科學版）， 2012， 30（6）： 51-57.

[6] Dombrecht B， Xue GP， Sprague SJ， et al. MYC2 differentially modulates diverse jasmonate-dependent functions in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2007，19（7）：2 225-2 245.

[7]趙悅.巴西橡膠樹乳管細胞茉莉酸信號途徑對橡膠生物合成調節的研究[D]. 海口： 海南大學， 2011.

[8] 何 鑫.巴西橡膠樹JAZ和MYC家族幾個成員基因表達和產量相關性的研究[D]. 海口： 海南大學， 2013.

[9] 包 杰. MYC和Myb轉錄因子對橡膠生物合成關鍵酶轉錄調節的研究[D]. 海口： 海南大學， 2014.

[10] 訾 亮， 洪 灝， 翟金玲， 等. 擬南芥NiNJA基因酵母雙雜誘餌載體的構建及互作蛋白的篩選[J]. 熱帶生物學報， 2013， 4（1）： 31-35.

[11] Wang X C， Wang D， Sun Y， et al. Comprehensive proteomics analysis of laticifer latex reveals new insights into ethylene stimulation of natural rubber production[J]. Scientific Reports， 5： 1-18. doi： 10.1038/srep13778.

[12] Dai L， Kang G， Li Y， et al. In-depth proteome analysis of the rubber particle of Hevea brasiliensis（para rubber tree）[J]. Plant Molecular Biology， 2013， 82（1-2）： 155-168. doi： 10.1007/s11103-013-0047-y.

[13] 鄧 治， 張云霞， 陳春柳， 等. 采用酵母雙雜交法篩選HbMyb1相互作用蛋白[J]. 植物生理學通訊， 2007， 47（6）： 1 031-1 034.

[14] 楊子平， 李輝亮， 郭 冬， 等.巴西橡膠樹乳管細胞中與 HbRZF相互作用蛋白的初步篩選與分析[J].熱帶作物學報 2013， 34（2）： 268-271.

[15] 曾日中， 李先昆， 聶智毅， 等.應用酵母雙雜交系統篩選橡膠延長因子REF的互作蛋白[J].熱帶亞熱帶植物學報， 2011， 19（5）： 400-406.

[16] 黃守程， 葉梅榮， 劉愛榮， 等. DNAJ-like蛋白在植物脅迫應答中的作用及機制研究進展[J].長江大學學報（自然科學版）， 2015， 12（9）： 57-62.

[17] 陳斯茗， 盧 山. 植物DnaJ-Like鋅指蛋白的功能研究[J]. 植物生理學報， 2015， 51 （5）：586-592.

[18] Zhao Y， Zhou L M， Chen Y Y， et al. MYC genes with differential responses to tapping， mechanical wounding， ethrel and methyl jasmonate in laticifers of rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. Journal of Plant Physiology， 2011， 168： 1 649-1 658.

[19] Holmgren A. antioxidant function of thioredoxin and clutaredoxin systems[J]. Antioxidants & Redox Signaling， 2000， 2（4）： 811-820.