MTNR1A基因ExonⅡT/C突變與綿羊季節(jié)性繁殖的關聯(lián)性分析

張偉 石國慶 鄧雙義 王世銀

摘要：【目的】分析MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變與綿羊季節(jié)性繁殖性狀的關聯(lián)性，為深入研究MTNR1A基因在綿羊繁殖活動中的作用機制打下基礎。【方法】以季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊和中國美利奴羊（軍墾型）及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊為研究對象，采用PCR-SSCP及測序技術檢測MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變在4個綿羊品種群體中的分布情況，并分析其與綿羊季節(jié)性繁殖性狀的關聯(lián)性。【結果】MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變致使MTNR1A蛋白的胞內(nèi)無規(guī)卷曲結構域構象發(fā)生變化。在4個綿羊品種群體MTNR1A基因ExonⅡ處均可檢測到T/C突變，其中阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型為主，T等位基因頻率分別為C等位基因的3.4和11.2倍；在中國美利奴羊（軍墾型）中則以TC基因型為主，TC基因型頻率分別為TT和CC基因型的17.6和19.6倍；在湖羊中3種基因型的分布無明顯差異。在阿勒泰羊群體中MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），而在中國美利奴羊（軍墾型）、湖羊和小尾寒羊群體中處于極度不平衡狀態(tài)（P<0.01）。【結論】在季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊和中國美利奴羊（軍墾型）及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群體MTNR1A基因ExonⅡ處均可檢測到T/C突變，但該突變與綿羊的季節(jié)性繁殖性狀無關聯(lián)。

關鍵詞： 綿羊；MTNR1A基因；ExonⅡ T/C突變；季節(jié)性繁殖；PCR-SSCP

中圖分類號： S826.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）09-1582-05

Abstract：【Objective】The relationship of T/C mutation of MTNR1A gene ExonⅡand seasonal reproduction traits of sheep（Ovis aries） was investigated， in order to further research mechanism of MTNR1A gene in reproduction. 【Method】Altay sheeps and Chinese Merino sheeps， which are seasonal estrous sheep breeds， Hu sheep and Small-tail Han sheep， which are perennial estrous sheep breeds， were chosen to detect distribution of T/C mutation of MTNR1A gene ExonⅡ in these four sheep breeds by PCR-SSCP and sequencing. 【Result】The result showed that， T/C mutation of MTNR1A gene ExonⅡ could cause change of random coil conformation of MTNR1A protein. T/C mutation was detected in four sheep breeds， and TT was main genotype in Altay sheep and Small-tail Han sheep， allele frequencies of T were 3.4 and 11.2 times as those of C， respectively. But in Chinese Merino sheep population， TC was main genotype， its genotype frequency was as 17.6 and 19.6 times as those of TT and CC respectively. There was non-significant difference in Hu sheep population. T/C mutational site of MTNR1A gene ExonⅡ was in Hardy-Weinberg balance status in Altay sheep population（P>0.05）， but was in extreme imbalance status in Chinese Merino sheep， Hu sheep and Small-tail Han sheep populations（P<0.01）. 【Conclusion】T/C mutation of MTNR1A gene ExonⅡ can be detected in Altay sheep and Chinese Merino sheep which are seasonal estrous sheep breeds， as well as Hu sheep and Small Tail Han sheep population which are perennial estrous sheep breeds， but this mutation is not correlated with seasonal reproduction trait of sheep.

Key words： sheep； MTNR1A gene； T/C mutation of ExonⅡ； seasonal reproduction； PCR-SSCP

0 引言

【研究意義】褪黑激素（Melatonin，MEL）在綿羊?qū)⑼饨绻庹招盘栟D(zhuǎn)變?yōu)轶w內(nèi)激素信號，進而引起生殖系統(tǒng)周期性活動的過程中發(fā)揮重要作用。MEL在體內(nèi)只有與其特異性受體MTNR特異性結合才能發(fā)揮其生理功能，MTNR基因的突變有可能改變蛋白結構，從而影響其生理功能的正常發(fā)揮（宋萍和趙志奇，2000）。因此，深入研究MTNR基因在季節(jié)性繁殖和常年繁殖綿羊品種中的突變情況，分析其與綿羊繁殖性狀的關聯(lián)性，對進一步闡明綿羊季節(jié)性繁殖的調(diào)控機理具有重要意義。【前人研究進展】Ebisawa等（1994）在爪蟾（Xenopus laevis）表皮黑色素細胞中首次克隆獲得MTNR基因。后續(xù)研究表明，根據(jù)MTNR與2-125I-MEL的結合能力可將動物體內(nèi)的MTNR分為MTNR1A、MTNR1B和MTNR1C三種亞型，但目前在哺乳動物中僅發(fā)現(xiàn)MTNR1A和MTNR1B亞型，且MTNR1B的活性很低，因此推測哺乳動物主要由MTNR1A介導完成MEL的生理功能（Xiao et al.，2007；Yasuo et al.，2009；Slominski et al.，2012）。鑒于此，在哺乳動物中主要針對MTNR1A開展了大量研究工作。MTNR1A為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，以α螺旋構成的7個跨膜區(qū)為其基本結構，N-端在胞外，C-端在胞內(nèi)（Delagrange and Boutin，2006）。MTNR1A基因在動物體內(nèi)廣泛表達，可能與其生理功能的多樣性有關（Ahn et al.，2012；王世銀等，2015a，2015b）。綿羊的MTNR1A基因定位于26號染色體上，由2個外顯子和1個內(nèi)含子構成（Pelletier et al.，2000）。已有大量研究結果表明，MTNR1A基因的某些單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）與綿羊的季節(jié)性繁殖性狀存在關聯(lián)性。Notter等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，MTNR1A基因第2外顯子604、605和612位堿基的錯義突變使其蛋白的氨基酸發(fā)生改變，并與綿羊的季節(jié)性繁殖性狀有關。Carcangiu等（2011）在Sarda羊MTNR1A基因ExonⅡ處檢測到A→G突變，發(fā)現(xiàn)+/+和+/-基因型個體人工授精后的受胎率和分娩率均顯著高于-/-基因型個體，且其生殖季節(jié)性越來越不明顯。Martínez-Royoa等（2012）從Rasa Aragonesa羊的MTNR1A基因啟動子和ExonⅡ區(qū)域分別檢測到17和11個SNP位點，且發(fā)現(xiàn)啟動子區(qū)域422、677位點及ExonⅡ區(qū)域612位點分別為T、A和T等位基因的個體大多數(shù)表現(xiàn)出常年發(fā)情。王世銀等（2015a）以阿勒泰羊和湖羊為研究對象，對MTNR1A基因5′側(cè)翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ的突變情況進行檢測，發(fā)現(xiàn)共有28處突變，且5′側(cè)翼序列g.15143697位點的T/C突變在阿勒泰羊群體中T等位基因的比例是湖羊群體的550倍，故推測該位點與綿羊的季節(jié)性發(fā)情有關。【本研究切入點】季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊和常年繁殖的湖羊MTNR1A基因ExonⅡ處存在T/C突變，致使纈氨酸（Val）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）（王世銀等，2015a）。這一突變是否會導致MTNR1A蛋白質(zhì)結構發(fā)生變化，進而影響綿羊季節(jié)性繁殖性狀，目前尚無相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】以季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊、中國美利奴羊（軍墾型）和常年繁殖的湖羊、小尾寒羊為研究對象，使用PCR-SSCP及測序技術檢測MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變在上述4個綿羊品種中的分布情況，并分析其與綿羊季節(jié)性繁殖性狀的關聯(lián)性，為深入研究MTNR1A基因在綿羊繁殖活動中的作用機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 血樣采集 選擇季節(jié)性發(fā)情的阿勒泰羊、中國美利奴羊（軍墾型）和常年發(fā)情的湖羊、小尾寒羊為研究對象。200份阿勒泰羊血樣采自阿勒泰羊種群核心區(qū)新疆阿勒泰富蘊縣，195份中國美利奴羊（軍墾型）血樣采自新疆紫泥泉種羊場，210份湖羊血樣采自江蘇省泰州海倫羊業(yè)有限公司，104份小尾寒羊DNA樣品由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所儲明星研究員饋贈。血樣均使用ACD抗凝，4 ℃保溫箱中運送回實驗室用于提取基因組DNA，或-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 1. 2 主要試劑 基因組DNA提取試劑所使用的酚、氯仿、異戊醇和乙醇等試劑，以及垂直板凝膠電泳所使用的丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、硝酸銀等試劑均為國產(chǎn)分析純，Taq酶、100 bp Maker購自寶生物工程（大連）有限公司，dNTP購自天根生化科技（北京）有限公司，PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒購自美國Promega公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 參照王世銀等（2015a）的方法提取基因組DNA，并進行濃度和純度檢測，合格的基因組DNA樣品-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 引物設計 檢索NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得綿羊MTNR1A基因序列NM_001009725 （ExonⅠ和ExonⅡ），采用Oligo 6.0設計ExonⅡ T/C突變上、下游引物，PCR片段長度210 bp，T/C突變位于擴增片段近中間位置，以利于SSCP檢測。上游引物：5'-CTATTCCTGTACCTTCACGCAG-3'，下游引物：5'-CCCAGCAAATGGCAAAGAGGAC-3'，Tm分別為58和60 ℃，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 PCR擴增及擴增產(chǎn)物檢測 PCR擴增參照王世銀等（2015a）的反應體系及擴增程序進行操作。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的用于SSCP檢測或4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 4 SSCP檢測及測序 SSCP檢測參照王世銀等（2015a）的方法，并委托北京六合華大基因公司完成測序，若測序結果出現(xiàn)套峰即判定為雜合子。

1. 2. 5 蛋白質(zhì)結構預測 根據(jù)堿基突變得到突變型蛋白的氨基酸序列，采用蛋白質(zhì)三級結構在線預測軟件3DLigandSite（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/tools.html）預測野生型和突變型蛋白的三級結構，并分析突變對MTNR1A蛋白結構的影響。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010統(tǒng)計不同群體的基因型及等位基因頻率，并使用卡方檢驗分析各群體中基因型頻率是否處于Hardy-Weinberg平衡。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

以4個綿羊品種基因組DNA為模板，PCR擴增突變位點所在片段，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果（圖1）顯示，引物特異性和擴增效率均較高，擴增片段大小與預期結果一致，可滿足后續(xù)SSCP檢測及測序的要求。

2. 2 SSCP檢測分型及測序結果

經(jīng)SSCP檢測合格的PCR擴增樣品用非變性聚丙烯凝膠電泳進行分型，然后選擇不同帶型的PCR產(chǎn)物進行測序，以確定不同帶型所對應的基因型，結果見圖2。從4個綿羊品種中共檢測出3種帶型，將不同帶型對應的PCR產(chǎn)物回收純化后進行測序，分別對應于TT、CC和CT基因型。

分別將野生型和突變型的MTNR1A氨基酸序列提交至在線預測軟件3DLigandSite，預測二者的三級結構，結果發(fā)現(xiàn)MTNR1A蛋白的主體由7個α螺旋構成的跨膜區(qū)組成（圖3），具有G蛋白偶聯(lián)受體家族成員的典型特征，其N-端在胞外，C-端在胞內(nèi)。野生型與突變型的MTNR1A蛋白三級結構相比，主要是位于胞內(nèi)一側(cè)連接兩個α螺旋的無規(guī)卷曲構象發(fā)生變化（圓圈所示部位）。而這一部位可能在MTNR1A將MEL的調(diào)控信號從胞外傳遞到胞內(nèi)的過程中發(fā)揮重要作用，因此推測野生型和突變型的活性會發(fā)生變化。

2. 3 T/C突變在不同綿羊品種中的多態(tài)性

采用PCR-SSCP對200份阿勒泰羊、195份中國美利奴羊（軍墾型）、210份湖羊和104份小尾寒羊基因組樣品中MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變的多態(tài)性進行檢測，結果見表1。由表1可看出，MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變在阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型為主，T等位基因頻率分別為C等位基因的3.4倍和11.2倍；在中國美利奴羊（軍墾型）中則以TC基因型為主，TC基因型頻率分別為TT和CC基因型的17.6倍和19.6倍；在湖羊中3種基因型的分布無明顯差異。雖然MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變在上述4個綿羊品種中存在多態(tài)性，且在阿勒泰羊、中國美利奴羊（軍墾型）和小尾寒羊群體中各基因型的分布存在差異，但這種差異與季節(jié)性繁殖性狀不存在明顯的關聯(lián)性，但是否對綿羊的其他性狀產(chǎn)生影響有待進一步研究。

卡方檢驗結果表明，在阿勒泰羊群體中MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P>0.05），而在中國美利奴羊（軍墾型）、湖羊和小尾寒羊群體中處于極度不平衡狀態(tài)（P<0.01），說明這3個品種群體中MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變位點受到選擇、突變或遷移等因素的影響。

3 討論

堿基突變是產(chǎn)生新基因和新性狀的重要途徑，發(fā)生在基因非編碼區(qū)的突變可能對基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控產(chǎn)生影響，使其表達發(fā)生上調(diào)或下調(diào)；而發(fā)生在基因編碼區(qū)的突變可使氨基酸發(fā)生改變，進而導致其蛋白功能發(fā)生變化，并最終影響動物性狀。MTNR1A為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員之一，屬于跨膜蛋白，N-端在胞外，C-端在胞內(nèi)（Delagrange and Boutin，2006），通過其胞外結構域與MEL結合，將調(diào)控信息傳遞到胞內(nèi)并激活Gi或Gq蛋白，通過PKA和PKC通路調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）、磷脂酶A2、鉀離子或鈣離子通道、鳥苷酸環(huán)化酶活性而介導胞內(nèi)信號傳導（Slanar et al.，2000；Pandi-Perumal et al.，2008）。

MTNR1A基因的某些突變會影響其蛋白功能特性，進而影響動物的某些性狀。由于MEL在介導光照信號和體內(nèi)激素信號中發(fā)揮重要作用，因此目前對MTNR1A基因突變與性狀的關聯(lián)性研究主要集中在一些易受光照影響的性狀方面，如雞的產(chǎn)蛋性能和綿羊的季節(jié)性繁殖等。宋倩等（2013）對壽光雞MTNR1A基因5'調(diào)控區(qū)的突變情況進行研究，共檢測到8個SNP位點，其中-100、-110、-126和-329位點的突變對壽光雞開產(chǎn)日齡和前期20～25周齡的產(chǎn)蛋數(shù)有顯著影響。Carcangiu等（2011）研究表明，MTNR1A基因ExonⅡ612位的A/G突變會影響Sarda母羊春季的受胎率。王世銀等（2015a）以阿勒泰羊和湖羊為研究對象，對MTNR1A基因5'側(cè)翼序列、ExonⅠ及ExonⅡ的突變情況進行檢測，共發(fā)現(xiàn)28處突變，且5'側(cè)翼序列g.15143697位點的T/C突變在阿勒泰羊群體中T等位基因的比例是湖羊群體的550倍，推測該位點與綿羊的季節(jié)性繁殖有關。本研究對MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變進行深入研究，并分析其與綿羊季節(jié)性繁殖間的關聯(lián)性，發(fā)現(xiàn)在季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊和中國美利奴（軍墾型）及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群體中均檢測到MTNR1A基因ExonⅡ T/C突變位點多態(tài)性；MTNR1A蛋白三級結構的預測結果也表明，該突變對MTNR1A胞內(nèi)無規(guī)卷曲結構域的構象產(chǎn)生了影響，但該多態(tài)分布與綿羊的季節(jié)性繁殖不存在明顯的關聯(lián)性，推測該突變引起的氨基酸改變或蛋白構象改變部位不是MTNR1A的活性中心，因此對受體活性未產(chǎn)生影響或該活性的改變不參與綿羊繁殖性狀的調(diào)控。

綿羊季節(jié)性繁殖是一個復雜的性狀，受體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及能量代謝相關系統(tǒng)的協(xié)同作用，所以該性狀必然受到多基因網(wǎng)絡調(diào)控。MEL及其受體MTNR1A只是該調(diào)控網(wǎng)絡中的一個轉(zhuǎn)換點，在光信號轉(zhuǎn)化為體內(nèi)激素信號的過程中發(fā)揮作用，因此對其功能及相關突變的研究必須放到該調(diào)控網(wǎng)絡中才可能得到更好的解釋。同時，MEL具有多種生理功能，如生物節(jié)律、調(diào)節(jié)睡眠、視網(wǎng)膜信號調(diào)節(jié)及血壓調(diào)節(jié)等（Renuka and Joshi，2010；McCarter et al.，2013；Shi et al.，2013），因此今后對綿羊MTNR1A基因相關突變生理功能的研究不應僅局限于季節(jié)性繁殖性狀。

4 結論

在季節(jié)性繁殖的阿勒泰羊和中國美利奴羊（軍墾型）及常年繁殖的湖羊和小尾寒羊群體MTNR1A基因ExonⅡ處均可檢測到T/C突變，其中阿勒泰羊和小尾寒羊中以TT基因型為主，中國美利奴羊（軍墾型）中以TC基因型為主，在湖羊中3種基因型的分布無明顯差異，但該突變與綿羊的季節(jié)性繁殖性狀無關聯(lián)。

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（責任編輯 蘭宗寶）