HPLC法測定梨果肉中的熊果苷和綠原酸

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HPLC法測定梨果肉中的熊果苷和綠原酸

摘要：本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定梨肉中熊果苷和綠原酸的含量。采用W ondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）為固定相，甲醇：磷酸水（pH 2.5）=25：75（V/V）為流動相，流速0.6m l/min，在280 nm、柱溫30℃下進行檢測。本法中熊果苷、綠原酸分別在0.0002～0.01mg/m l、0.001～0.05mg/m l濃度范圍內呈線性關系，其相關系數分別為0.9987、0.9994，相對標準偏差分別為2.88%、1.04%，標準加入回收率分別為99.2%、99.6%。該方法操作簡單，準確度高，整個試驗的精密度和回收率良好，可用于梨果肉中熊果苷、綠原酸的快速檢測。

關鍵詞：梨果肉；熊果苷；綠原酸；高效液相色譜法

熊果苷和綠原酸是梨果實中最具代表性的活性成分。熊果苷又名熊果素，是源于綠色植物的天然活性物質，能夠通過抑制體內絡氨酸酶的形成來阻止黑色素的形成，是當今流行的最為安全的美白原料，也是理想的皮膚美白祛斑活性劑，主要用于高級化妝品的制備。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，有抗誘變、保肝利膽、抗菌抗病毒及解痙等作用，在藥品、保健品、食品行業、化妝品行業的開發利用價值很大。因此，研究梨肉中的熊果苷和綠原酸有十分重要的作用和意義。

目前關于熊果苷和綠原酸的測定方法使用最多的就是高效液相色譜法，該方法操作簡單，分析速度快，準確度高，可以同時測定多種酚類物質。本試驗旨在進一步優化條件，更加準確、快速地測定梨果肉中熊果苷和綠原酸的含量。

1　材料與方法

1.1試驗材料。雪梨、鴨梨購于邢臺家樂園超市。

1.2試驗藥品。甲醇、乙腈、熊果苷、綠原酸為色譜純；濃磷酸為分析純；實驗用水為超純水。

1.3試驗儀器。LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-M 20A二極管陣列檢測器），日本島津公司；FA2004電子天平，上海精密儀器公司；KQ-50B型超聲波清洗器，天津市瑞普電子儀器公司；SC-3612低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；PHS-3C型數字式酸度計，江蘇江分電分析儀器有限公司。

1.4標準溶液的配制。配制濃度為熊果苷0.01mg/m l、綠原酸0.05mg/m l標準溶液。

1.5梨肉樣品的處理。準確取稱取鴨梨果肉（去皮）10.2208 g，加入80%甲醇100m l，勻漿1min。取上清液20 m l，在4 000 r/m in的轉速下，離心10m in，取上清液過0.45μm濾膜，進樣10μl。

準確稱取雪梨樣品11.6410 g，按如上步驟制取雪梨樣品。

1.6色譜條件。Wondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇∶磷酸水（pH2.5）=25∶75 （V/V），流速：0.60m l/m in，在波長280 nm、柱溫為30℃條件下進行檢測。

2　結果與討論

2.1流動相的優化

2.1.1有機溶劑含量的選擇。在其他條件保持不變的情況下，探究甲醇：水相（pH2.5）在四個不同比例（20∶80、25∶75、30∶70、40∶60）下熊果苷和綠原酸的色譜圖（圖1）。

圖1　不同流動相比例標樣分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；a、b、c、d甲醇∶水相（pH2.5）分別為20∶80、25∶75、30∶70、40∶60

分析圖1和圖2可得，隨著有機相比例的增加，出峰時間越來越短，但是當流動相比例增加到30∶70、40∶60時，梨肉樣品中熊果苷峰形明顯不如25∶75時效果好，所以綜合考慮，流動相比例選擇25∶75。

圖2　不同流動相比例梨肉樣品分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；e、f、g甲醇：水相（pH2.5）分別為25∶75、30∶70、40∶60

2.1.2水相pH值的選擇。pH值對出峰時間和峰形都有一定的影響。在其他條件不變的情況下，設置4個磷酸水溶液pH值（2.10、2.50、3.00、3.50）進行試驗。分析圖3可得知，pH值為3.50時綠原酸的保留時間太長，所以不選擇。pH值為2.10、2.50和3.00時出峰時間相當，但pH值為2.10時，接近色譜柱的使用下限，所以不選擇。

圖3　不同pH值標樣分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；h、i、j、k的pH值分別為2.10、2.50、3.00、3.50

結合圖4得知，pH值為3.00時，兩個梨肉樣品中熊果苷的分離效果不及2.50時的好，所以pH值選擇2.50作為試驗條件。

圖4　不同pH值梨肉樣品色譜圖的比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；l、m的pH值分別為2.50、3.00。

2.1.3溫度的選擇。其他條件保持不變，分別探究在室溫22℃和30℃條件下熊果苷和綠原酸的出峰情況，見圖5。30℃時，熊果苷和綠原酸的出峰時間早于22℃時的情況，因此溫度選擇30℃作為試驗條件。

圖5　不同溫度的色譜圖比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；n、o分別為22℃、30℃。

2.1.4流速的選擇。保持其他條件不變，分別探究流速為0.6m l/m in和0.8m l/m in時熊果苷和綠原酸的分離情況，結果如圖6所示。

圖6　不同流速的色譜圖比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；p、q分別為0.6、0.8m l/m in

由圖6可知，流速為0.6m l/m in時，熊果苷和綠原酸的保留時間要比0.8m l/m in時的長，但綜合考慮理論塔板數和分離度，流速為0.6m l/min時理論塔板數和分離度高于0.8m l/m in，所以流速選擇0.6m l/m in作為試驗條件。

表1　不同比例流動相中熊果苷和綠原酸的分離情況

2.2線性關系考察。用流動相逐級稀釋混合標準液，配制成含熊果苷濃度（mg/m l）依次為0.0002、0.0001、0.0025、0.005、0.01的溶液，綠原酸濃度（mg/m l）依次為0.001、0.005、0.0125、0.025、0.05的溶液。進樣10μl。以樣品濃度c對峰面積A作圖，見圖7，熊果苷在0.0002～0.01mg/m l濃度范圍內呈線性關系，其回歸方程為：y=32475762.77 x+6590.85，相關系數R2=0.9987。綠原酸在0.001～0.05mg/m l濃度范圍內呈線性關系，回歸方程為：y=23136381.58 x+4241.06，相關系數R2= 0.9994。

圖7　標準曲線圖注：圖中r、s分別為熊果苷、綠原酸

2.3精密度。取熊果苷和綠原酸的標準混合液10μl進樣，連續測定3次，計算其相對標準偏差（RSD），見表2。由表2可知，研究對象相對標準偏差（RSD）分別為2.88、1.04，結果表明本試驗的精密度良好。

表2　精密度測定結果（n=3）

2.4回收率。分別精確移取熊果苷和綠原酸標準試樣，配制成1.5、3.0、4.5μg/m l熊果苷溶液，1.5、3.0、4.5μg/m l綠原酸溶液，三組試樣，在色譜條件下（見1.6），分別進樣10μl，根據所得峰面積用回歸方程計算回收率及其相對標準偏差（RSD）。熊果苷、綠原酸的平均回收率分別為99.2%、99.6%，相對標準偏差分別為0.46%，0.33%。結果表明，本方法回收率較好，且兩種互不干擾。

2.5樣品測定。分別準確吸取在實驗條件（1.5）下制得的雪梨、鴨梨樣品溶液10μl，按色譜條件（1.6）進樣。由圖8可見，熊果苷和綠原酸兩組分可以很好的分離、測定。計算得出雪梨梨肉中熊果苷含量為7.8667μg/g，綠原酸含量為210.9333μg/g；鴨梨梨肉中熊果苷含量為14.0667μg/g，綠原酸含量為88.2667μg/g。

圖8　梨肉中熊果苷和綠原酸的測定注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；r、s分別為鴨梨、雪梨

3　結論與展望

本文采用HPLC法同時測定了梨肉中熊果苷和綠原酸含量，經過探索分析，得到最優色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）為固定相；甲醇—水（25∶75，V/V）為流動相，水相是pH值為2.5的磷酸溶液，流速為0.6m l/m in，在波長280 nm、柱溫30℃下進行檢測。此方法操作簡單，分析時間短，18m in內可完成測定，分離效果好，線性關系良好，精密度、回收率高，還可同時分離和測定梨果肉中的熊果苷和綠原酸，在梨果實活性成分研究和檢測中有重要意義，也為醫藥保健、食品行業、化妝品行業中綠原酸、熊果苷的研究和檢測打下了基礎。

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