基于p38 MARK 信號通路探討益氣生肌合劑聯合三乙醇胺乳膏對壓瘡大鼠模型皮損及血清炎癥因子的影響

唐玉利 劉欣 廖若夷

1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院老年病科，湖南長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院護理部，湖南長沙 410208

壓瘡嚴重降低了患者生存質量[1-2]。單純運用負壓引流治療壓瘡臨床效果仍欠佳[3-4]。中醫學中壓瘡應屬“席瘡”范疇[5]，運用中西醫結合治療本病可取得較好效果[6-7]。益氣生肌合劑臨床應用多年，在創面修復中取得較好療效，本研究進一步探討其對壓瘡大鼠模型皮損、血清炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

50 只SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，6～7 周齡，180～200 g，購自湖南中醫藥大學動物實驗中心，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004，合格證號：43072663411 014472，自由攝食。

1.2 實驗藥物

益氣生肌合劑由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供（批號：20210105，規格100 g/瓶）；三乙醇胺乳膏[法國Biafine Act 公司生產，注冊號：（進）H20120425，規格：46.5 g/支]。

1.3 主要試劑與儀器

p38 絲裂素活化蛋白激酶（p38mitogen-activatedproteinkinase，p38 MARK）抗體（CST，批號：8690P）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（CST，批號：65373P）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases，MMP-9）抗體（CST，批號：D6O3H）；PBS（Hyclone，貨號：80334412）；酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）IL-2、IL-12、CRP 試劑盒（武漢博士德生物，貨號：EK0404、EK0421、EK1316）。蛋白電泳儀（北京六一，型號：DYY-2C），其余儀器耗材由實驗室提供。

1.4 動物分組

將大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組、三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯合用藥組，每組10 只。

1.5 壓瘡大鼠模型的建立

參照姜麗萍等[8]的壓瘡大鼠模型建立方法制備壓瘡大鼠模型，假手術組僅同部位埋入磁鐵不予壓力裝置加壓。

1.6 動物給藥

根據人等效劑量換算[9]將大鼠益氣生肌組給藥劑量設定為12.98 g/（kg·d）。假手術組與模型組給予生理鹽水0.4 ml 灌胃；三乙醇胺乳膏組大鼠予三乙醇胺乳膏外用，2 次/d；益氣生肌組予益氣生肌合劑灌胃，1 次/d；聯合用藥組為上述藥物聯合使用各組均連續干預8 d。

1.7 標本采集

最后一次給藥1 h 后，于眼眶處取血約1.0 ml，4℃環境下1 500 r/min 離心5 min，離心半徑16 cm，取上清置于-20℃冰箱備檢。斷頸處死后取各組大鼠皮損部位組織備檢。

1.8 觀察指標

1.8.1 形態學觀察 觀察各組大鼠干預前后的皮損情況，皮損面積（cm2）計算方法為最大長度（cm）×最大寬度（cm）。

1.8.2 病理觀察 取各組大鼠皮損組織制備石蠟切片，蘇木精-伊紅染色后顯微鏡下觀察病理情況。

1.8.3 血清炎癥因子檢測 ELISA 測定各組大鼠血清白細胞介素（interleukin，IL）-2、IL-12、C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。嚴格按照試劑盒說明書操作，借助酶標儀進行檢測。

1.8.4 p38 MARK 信號通路蛋白檢測 提取各組大鼠皮損組織總蛋白，加入SDS 緩沖液煮沸5 min 使蛋白變性。凝膠電泳轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉孵育1 h，添加一抗抗體p38 MARK（1∶5 000）、VEGF（1∶500）、MMP-9（1∶1 000）和β-actin(1∶1 000），4℃過夜，TBST 洗膜3 次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，TBST 洗膜3 次，每次5 min。顯色后以β-actin 作為內參，計算各蛋白灰度值。

1.9 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件處理數據，計量資料采用均數±標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組創面形態學觀察

干預8 d 后，假手術組大鼠皮膚創面結痂已脫落，皮膚顏色恢復正常；模型組大鼠見壓瘡皮損愈合緩慢，其余各組大鼠的壓瘡皮損均存在不同程度的愈合結痂。見圖1。

圖1 各組創面形態學情況

2.2 各組皮損面積比較

假手術組大鼠的創面在第8 天已完全愈合。三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯合用藥組造模第8 天皮損面積低于模型組，聯合用藥組造模第8 天皮損面積低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組皮損面積比較（cm2，）

表1 各組皮損面積比較（cm2，）

注 與模型組比較，aP＜0.05；與三乙醇胺乳膏組比較，bP＜0.05；與益氣生肌組比較，cP＜0.05

2.3 各組皮損組織病理學情況

假手術組皮損組織細胞結構排列整齊，未見炎性浸潤。模型組皮損組織周圍存在明顯的炎性浸潤及壞死碎片，組織可見明顯的空泡變性；其余各組可見皮損組織炎性浸潤明顯緩解，壞死碎片及空泡化現象明顯減少，其中聯合用藥組緩解程度最佳。見圖2。

圖2 各組皮損組織病理學情況（HE 染色，200×）

2.4 各組血清炎癥因子水平比較

模型組IL-2、IL-12、CRP 血清炎癥因子水平高于假手術組（P＜0.05）；三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯合用藥組IL-2、IL-12、CRP 血清炎癥因子水平均低于模型組，且聯合用藥組低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見圖3。

圖3 各組血清炎癥因子水平比較（n=10）

2.5 各組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表達情況

模型組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平高于假手術組（P＜0.05）。三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組、聯合用藥組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平均低于模型組，且聯合用藥組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 蛋白表達水平低于三乙醇胺乳膏組、益氣生肌組（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組皮損組織p38 MARK、VEGF、MMP-9 的蛋白表達情況（n=10）

3 討論

壓瘡多以局部肌膚壞死潰瘍，創面遷延難愈等為特征[10-11]。中醫學認為本病治療的總體原則為扶正祛邪，標本兼治[12-16]。p38 MAPK 信號通路與壓瘡的炎性機制聯系緊密，p38 MAPK 信號通路激活后，IL-2、IL-12、CRP、腫瘤壞子因子-α 等炎癥因子大量釋放，對皮損組織的病理性重構起到了極為重要的調控作用[17-19]。與p38 MAPK 信號通路密切相關的VEGF、MMP-9 等因子所介導的血管平滑肌細胞增殖，參與了結締組織增生與局部的血管重建與再塑，同時p38 MAPK 信號通路能夠密切參與到細胞增殖、分化、凋亡及相關炎癥反應中[20-23]。MMP-9、VEGF 是受p38 MAPK 信號通路調控的對細胞損傷與修復起重要調控作用的細胞因子[24]。p38 MAPK 信號通路緊密參與到細胞增殖、分化、凋亡及多種關鍵細胞因子合成等方面，在壓瘡的諸多生理病理調控中起到關鍵作用，是壓瘡的損傷與修復過程中的關鍵分子機制之一[25-26]。本研究治療壓瘡提供新的思路與基礎研究證據。

綜上所述，益氣生肌合劑與三乙醇胺乳膏聯用可有效修復壓瘡大鼠模型皮損，降低血清炎癥因子水平，其可能與益氣生肌合劑調控p38 MAPK 信號通路密切相關。