小麥體細胞無性系HMW-GS組成、蛋白質和賴氨酸含量及SSR位點變異分析

王 煒，楊隨莊，葉春雷，陳 琛，歐巧明，王紅梅，羅俊杰

(1.甘肅省農業科學院生物技術研究所，甘肅蘭州 730070； 2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010)

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小麥體細胞無性系HMW-GS組成、蛋白質和賴氨酸含量及SSR位點變異分析

王 煒1，楊隨莊2，葉春雷1，陳 琛1，歐巧明1，王紅梅1，羅俊杰1

(1.甘肅省農業科學院生物技術研究所，甘肅蘭州 730070； 2.西南科技大學生命科學與工程學院，四川綿陽 621010)

摘要：為明確小麥體細胞無性系后代材料的蛋白質和賴氨酸含量、HMW-GS及SSR位點變異情況，對寧春4號、隴春21號和花培9355三個小麥品種的無性系R4和R5代材料的蛋白質和賴氨酸含量、HMW-GS組成及SSR位點進行檢測和鑒定，并分析其變異情況。結果表明，三個小麥品種無性系后代中，編碼HMW-GS的三個位點均可發生變異，不同基因型材料的無性系后代的變異頻率和位點并不相同，同一基因型無性系后代的不同編碼位點的變異頻率也不相同；蛋白質和賴氨酸含量出現超親變異，其中大部分材料在R4代中表現出的變異性狀能夠穩定傳遞到R5代中。小麥體細胞無性系SSR位點的變異具有基因型依賴性，蛋白質和賴氨酸含量的變異頻率與SSR位點變異頻率無直接的相關性。

關鍵詞：小麥；體細胞無性系；變異；品質育種

小麥品質包括營養品質和加工品質。小麥籽粒的蛋白質含量對其營養品質和加工品質均有重要影響，蛋白質含量的提高，有利于小麥品質的改善[1]。小麥蛋白質的氨基酸組成極不平衡，賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等含量較低，其中賴氨酸的含量只能滿足人體需要的45%，因此被稱為小麥的第一限制性氨基酸[2]。麥谷蛋白約占小麥籽粒總蛋白質的10%和面筋蛋白的35%，對小麥的加工品質有決定作用[3]。利用SDS-PAGE技術，可將小麥麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基(HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(LMW-GS)，其中HMW-GS的組成和含量是影響小麥烘烤品質的重要因素[4-5]，也是目前國內小麥品種烘烤品質的主要限制因子[6]。因此，提高小麥籽粒的蛋白質和賴氨酸含量、改變HMW-GS的組成，是目前我國小麥品質育種的優先目標和重要任務[2,7-8]。

大量研究表明，體細胞無性系變異是植物組織培養過程中出現的普遍現象，且絕大多數變異可以遺傳，因此可用于作物的遺傳改良[9-14]。對小麥體細胞無性系變異的研究表明，小麥籽粒蛋白質和氨基酸含量、HMW-GS亞基組成均可產生明顯變異[15-18]，提示利用體細胞無性系變異可進行小麥品質性狀改良。目前，對于小麥體細胞無性系變異的大部分研究僅局限于單一品質性狀，如蛋白質或賴氨酸含量、HMW-GS組成，對小麥體細胞無性系變異后代在不同品質性狀變異上的相關性、變異的生化與分子基礎方面的報道較少。本研究以小麥品種寧春4號、隴春21號和花培9355及其農藝性狀已穩定的194份R4和R5代體細胞無性系后代為材料，檢測、鑒定這些材料的蛋白質含量、賴氨酸含量、HMW-GS組成及SSR位點，分析這些性狀的變異情況，以期獲得具有優異品質性狀的體細胞無性系小麥種質材料，為補充和完善體細胞無性系品質變異機理提供一定支持，為利用體細胞無性系變異進行小麥種質資源創制和品質改良提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

以小麥品種寧春4號、隴春21號、花培9355及其幼胚培養所獲得的農藝性狀已穩定的194個R4代及R5代為試驗材料，其中寧春4號無性系后代材料40份，隴春21號無性系后代材料62份，花培9355無性系后代材料92份。194個材料的獲得和培養方法同前期工作[14]。

1.2檢測項目與方法

1.2.1小麥籽粒蛋白質和賴氨酸含量測定

選取完整無蟲蛀的無性系R4和R5代小麥種子(50 g)置于60℃恒溫箱中干燥5～6 h，待室溫后用旋式粉碎機磨碎，過0.25 mm篩后于磨口瓶中備用。蛋白質含量測定采用凱氏法(GB5511-85)；賴氨酸含量測定采用染料結合法(GB4801-1984)。以各自當年收獲的供體親本種子為對照，結果均以全麥粉干基表示。

1.2.2HMW-GS組成檢測

參考歐巧明等[6]和葉春雷等[19]的方法，采用不連續SDS-PAGE法對小麥寧春4號、隴春21號和花培9355的各6份R5代無性系后代材料進行HMW-GS組成檢測，亞基的編碼和命名參照Payne等的方法[20]。

1.2.3SSR位點的PCR擴增

參考楊隨莊等[21]方法，利用所篩選的多態性較好的30對SSR引物對小麥寧春4號、隴春21號和花培9355的各6份R5無性系后代材料進行PCR擴增，引物序列代號分別為Xgwm6-4D、Xgwm33-1A、Xgwm47-2A、Xgwm60-7A、Xgwm72-3B、Xgwm88-6B、Xgwm95-2A、Xgwm99-1A、Xgwm113-4B、Xgwm120-2B、Xgwm131-1B、Xgwm157-2D、Xgwm159-5B、Xgwm161-3D、Xgwm169-6A、Xgwm194-4D、Xgwm219-6B、Xgwm257-2B、 Xgwm272-5D、Xgwm325-6D、Xgwm339-2A、Xgwm340-3B、Xgwm357-1A、Xgwm495-3B、Xgwm512-2A、Xgwm513-4B、 Xgwm537-7B、Xgwm539-2D、Xgwm577-7B、Xgwm583-5D，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3數據處理

利用SPSS 13.0軟件進行方差分析和多重比較；利用EXCEL 2003軟件作圖。

2結果與分析

2.1蛋白質含量的變異與遺傳

由圖1可知，42份寧春4號(WSNC 4)、60份隴春21號(WSLC 21)和92份花培9355(WSHP 9355)的無性系R4代材料中，籽粒蛋白質含量較親本顯著增高的比例均超過50%(P<0.05)，顯著低于親本的材料比例均小于10%。以WSNC 4為例，親本的蛋白質含量為13.89%，其42份R4代無性系材料的蛋白質含量介于12.52%～17.97%之間，平均值為16.27%，蛋白質含量平均較親本提高了17.13%；27份材料的蛋白質含量顯著高于對照，占測定材料數的64.29%；與親本差異不顯著的有12份，占28.57%；顯著低于親本的僅有3份，占7.14%。WSLC 21和WSHP 9355的無性系R4代材料的籽粒蛋白質含量的分布規律與WSNC4相似。可見， WSNC 4、WSLC 21和WSHP 9355無性系R4代蛋白質含量變異均有向高蛋白質含量方向變異的趨勢，平均比親本高17.13%、26.62%和9.38%。WSNC 4、WSLC 21和WSHP 9355的無性系R5代材料的蛋白質含量顯著高于相應親本的分別占52.38%、51.67%和63.04%。說明小麥無性系材料在R4代表現出的蛋白質含量變異性狀能夠較穩定地傳遞到R5代。

圖1　小麥體細胞無性系R4和R5代材料蛋白質含量的分布頻率

圖2　小麥體細胞無性系R4和R5代材料賴氨酸含量的分布頻率

2.2賴氨酸含量的變異與遺傳

WSNC 4的賴氨酸含量為0.45%，參試的42份R4無性系后代材料的賴氨酸含量介于0.44%～0.60%之間，平均值為0.55%，賴氨酸含量平均較親本提高了22.22%；29份(69.05%)材料的賴氨酸含量顯著高于親本(P<0.05)，13份(30.95%)材料與親本差異不顯著(圖2)。WSLC 21的R4無性系后代的賴氨酸含量平均較親本提高了12.50%，有43份(71.67%)材料的賴氨酸含量顯著高于親本。WSHP 9355的R4代無性系材料的賴氨酸含量平均較親本提高了6.52%，34份(36.96%)材料的賴氨酸含量顯著高于親本，63.04%材料與其親本差異不顯著。與其蛋白質含量進行比較發現，相同蛋白質含量時，WSNC4、WSLC21的R4無性系后代材料的賴氨酸含量有提高變異趨勢，WSHP9355的R4后代高賴氨酸含量有降低變異趨勢。3個小麥品種的R5代無性系材料的賴氨酸含量與R4代變化趨勢相同，WSNC 4、WSLC 21和WSHP 9355的R5代無性系材料的賴氨酸含量分別有73.81%、78.33%和35.87%顯著高于相應的親本。說明大部分材料在無性系R4代表現出的賴氨酸含量變異性狀亦能夠穩定傳遞到R5代。

2.3HMW-GS變異分析

1：Zhongyou 9507；2 WSNC 4-1; 3:WSNC 4-2; 4: WSNC 4-3; 5: WSNC 4-4; 6: WSNC 4-5; 7:WSNC 4-6; 8: WSNC 4; 9 : Zhongyou 9507: 10: WSLC 21; 11:WSLC 21-1; 12:WSLC 21-2; 13:WSLC 21-3; 14:WSLC 21-4; 15:WSLC 21-5; 16: WSLC 21-6; 17 :Zhongyou 9507; 18:WSHP 9355-1; 19:WSHP 9355-2; 20: WSHP 9355-3; 21:WSHP 93554-4; 22:WSHP 9355-5; 23:WSHP 9355-6; 24: WSHP 9355

圖3WSNC 4(A)、WSLC 21(B)和WSHP 9355(C)及其親本無性系R5代的HMW-GS組成比較

Fig.3HMW-GS composition of wheat R5somaclonal lines and their donor parents

從WSNC 4、WSLC 21和WSHP 9355的R5代無性系后代中各隨機選取6份材料，利用SDS-PAGE電泳法對其HMW-GS組成進行鑒定分析。結果顯示，大部分材料的亞基組成發生了變異(圖3)。WSNC 4的HMW-GS組成為1、17+18、5+10，在被測的6份無性系R5代材料中，4份材料(WSNC 4-1至WSNC 4-4)的HMW-GS組成發生了變異，變異頻率為66.67%，其中在兩個位點發生變異的有WSNC 4-1和WSNC 4-2，WSNC 4-1在Glu-A1位點的表達產物缺失，在 Glu-B1位點的表達產物由供體親本的17+18亞基變為7+9；WSNC 4-2在 Glu-B1位點的表達由17+18變為7+9，在 Glu-D1位點由5+10變為2+12；WSNC 4-3在 Glu-B1位點的表達由17+18變為7+9；WSNC 4-4在 Glu-D1位點的表達由5+10變為2+12。

WSLC 21的HMW-GS組成為1、7+8、2+12，參試的6份無性系R5代材料(WSLC21-1至WSLC21-6)的HMW-GS組成均發生了變異，變異頻率為100%。WSLC 21-1在 Glu-B1位點的表達由供體親本的7+8變為17+18，在 Glu-D1位點2+12變為5+10；WSLC 21-2在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9， Glu-D1位點由2+12變為5+10；WSLC 21-3在 Glu-A1位點的表達缺失， Glu-D1位點由2+12變為5+10；WSLC 21-4的表達 Glu-A1位點的表達缺失，在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9；WSLC 21-5在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+8*；WSLC 21-6在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9，在 Glu-D1位點的表達由2+12變為5+10。

WSHP 9355的HMW-GS組成為1、7+8、5+10，參試的6份無性系R5材料(WSHP 9355-1至WSHP 9355-6)的HMW-GS亞基組成均發生了變異，變異頻率為100%。其中WSHP 9355-1和WSHP 9355-2在 Glu-A1位點基因的表達產物由供體親本的1變為1*，在 Glu-D1則由5+10變為2+12；WSHP 9355-2在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9；WSHP 9355-3在 Glu-A1位點缺失，在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9；WSHP 9355-4在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9；WSHP 9355-5在 Glu-D1位點的表達由5+10變為2+12；WSHP 9355-6在 Glu-B1位點的表達由7+8變為7+9。

由上可知，無性系材料在HMW-GS的所有位點均可產生變異，不同基因型材料的無性系后代HMW-GS變異頻率和編碼位點并不相同，同一基因型的無性系后代的不同HMW-GS編碼位點的變異頻率也不相同。總體來說， Glu-B1位點的變異頻率最高，為77.78%，其次為 Glu-D1位點，為55.56%， Glu-A1位點的變異頻率最低，為27.68%。

2.4無性系SSR位點變異分析

1: WSNC 4-1; 2：WSNC 4-2; 3：WSNC 4-3; 4：WSNC 4-4; 5：WSNC 4-5; 6：WSNC 4-6; CK(A)：WSNC 4,M：Marker (200bp); 7：WSLC 21-1; 8：WSLC 21-2; 9：WSLC 21-3; 10：WSLC 21-4; 11：WSLC 21-5; 12：WSLC 21-6 ; CK(B)：WSLC 21; 13:WSHP 9355-1; 14：WSHP 9355-2; 15：WSHP 9355-3;16：WSHP 9355-4; 17：WSHP 9355-5; 18：WSHP 9355-6; CK(C)：WSHP 9355

圖4用Xgwm 495(A)、Xgwm 513(B)、Xgwm 495(C) 對R5無性系后代及其親本的PCR擴增圖

Fig.4PCR amplification in wheat R5somaclonal lines and their donor parents

using Xgwm 495(A)，Xgwm 513(B)，Xgwm 495(C)

分別利用所篩選的多態性較好的30對SSR引物對3個小麥品種的R5無性系后代材料進行PCR擴增，結果顯示，被測材料均出現多態性位點(圖4)，PCR擴增片段遷移率增大或減小的出現頻率顯著高于缺失或出現新的PCR擴增片段的頻率(表1)。WSNC 4中，PCR擴增片段增大的平均為3.2個位點，減小的為2.6個位點，片段增加和缺失的均為0.6個位點，SSR位點的平均變異頻率為23.33%；WSLC 21中，PCR擴增片段增大的平均為3.4個位點，減小的為3.6個位點，片段增加的為0.4個位點，缺失的為0.6個位點，SSR位點的平均變異頻率為27.22%；WSHP 9355中，PCR擴增片段增大和減小的位點平均分別為4.9和4.8，片段增加的為0.4個位點，缺失的為1.4個位點，SSR位點的平均變異頻率為35.09%。由此可以看出，不同小麥品種的R5無性系后代材料的變異頻率不盡相同，說明在無性系材料中，SSR位點的變異具有基因型依賴性。蛋白質和賴氨酸含量的變異幅度與SSR位點變異頻率無相關性(表1)，如WSNC 4-1的蛋白質和賴氨酸含量分別為17.56%和0.52%，其SSR位點變異頻率為20.00%，WSNC 4-3的蛋白質和賴氨酸含量分別為13.66%和0.49%，其SSR位點變異頻率為36.67%。

3討 論

小麥籽粒蛋白質含量是衡量其加工品質和營養品質的重要指標，也是小麥品種審定和商品小麥定級的主要指標之一。小麥籽粒蛋白質含量是由多基因控制的數量性狀，同時受環境因素的影響[7,22]，應用常規育種方法很難獲得超高品種。研究表明，采用組織培養[15-16]、外源DNA導入[6]和輻射誘變[23]等手段，可增加小麥籽粒蛋白質含量變異頻率，促進小麥的品質改良。本研究通過對3個小麥品種的幼胚進行培養，在R4代獲得了蛋白質含量與原親本有明顯差異的無性系后代變異材料，且絕大部分材料蛋白質含量的超親變異性狀能夠遺傳到R5代，與朱至清[13]等、王 培[15]等研究結果類似，進一步證明了利用體細胞無性系變異提高小麥籽粒蛋白含量的有效性和可行性。

小麥是我國北方地區人民重要的食物和營養來源。小麥籽粒中賴氨酸含量很低，遠遠不能滿足人體的需要，因此提高小麥蛋白質中賴氨酸含量至關重要[24]。已有研究表明，在高蛋白質含量的小麥體細胞無性系材料中，各種氨基酸絕對含量也相應增高[16]。本研究結果表明，小麥體細胞無性系后代材料的賴氨酸含量具有超親變異并可遺傳。在蛋白質含量超過親本的無性系材料中，有85%的無性系材料的賴氨酸含量超過其親本，然而賴氨酸含量與蛋白質含量并不相關，這與宋亞珍等的報道相似[25]。

麥谷蛋白是小麥蛋白的主要成分之一，對小麥的加工品質有重要影響[6,8,17]。小麥高分子量麥谷蛋白(HMW-GS)由遺傳控制，其等位變異豐富，HMW-GS的3個位點(Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1)對品質的貢獻存在加性效應，是影響小麥面筋品質的重要因素[3,24]。目前普遍認為 Glu-A1位點編碼的1、2*、Glu-B1位點編碼的7+8、17+18、Glu-D1位點編碼的5+10等亞基通常賦予面團良好的彈性和韌性，具有較好的品質效應。檢測小麥品種的 HMW-GS 組成已成為國內外評價和預測小麥品質的主要依據[19,26]。研究表明，經組織培養所獲得的體細胞無性系后代材料的HMW-GS亞基組成可產生變異并可穩定遺傳[27]。本研究中，3個小麥品種的R5代無性系材料的HMW-GS亞基組成均有變異且變異頻率較高。寧春4號和花培9355均具有較好的優質亞基組成，其HMW-GS位點發生的變異主要為負向變異，即由優質亞基變為劣質亞基，隴春21號的無性系后代材料中，存在劣質亞基(2+12)變為優質亞基(5+10)的現象。結合張懷剛等人的研究[17,27]，認為體細胞無性系變異是對HMW-GS亞基組成較差的品種進行改良的途徑之一。

表1　3個小麥品種體細胞無性系R5代材料的SSR位點變異

Ryan[9]、胡尚連[28]等研究結果表明，蛋白質含量變異能夠遺傳。本研究中，3個小麥品種的R5無性系后代材料存在HMW-GS亞基組成較原親本差、籽粒蛋白質和賴氨酸含量比相應親本低的情況，這進一步說明體細胞無性系變異的雙向性。由于變異的后代中會出現亞基組成較優、蛋白質和賴氨酸含量較高的株系，因而體細胞無性系變異方法不失為一種小麥品質改良的有效手段。

植物組織培養所產生的無性系變異有其遺傳基礎，目前的研究認為體細胞無性系變異是由于染色體核型的改變、基因突變、堿基序列改變、基因擴增或丟失、基因重排、DNA甲基化、轉座子插入而影響基因的表達等原因所造成[27,29-31]。前期研究表明，在小麥體細胞無性系后代材料中的SSR位點發生了變異，出現PCR擴增片段的增大、減小、增加或缺失的現象，SSR位點變異頻率和基因型有關[21]，本研究的結果與此類似，并發現蛋白質和賴氨酸含量的變異幅度與SSR位點變異頻率并無直接的相關性。由SDS-PAGE電泳法進行小麥HMW-GS檢測發現，小麥無性系后代的HMW-GS編碼基因或調節基因與親本有一定變異，其確切的分子機制有待于進一步的研究。

4結 論

4.1小麥體細胞無性系后代蛋白質和賴氨酸含量具有超親變異，其中大部分材料在R4代中表現出的這種變異性狀能夠穩定傳遞到R5代中。

4.2小麥體細胞無性系材料在三個編碼HMW-GS的位點均可產生變異，不同基因型材料的無性系后代的HMW-GS變異頻率和編碼位點并不相同，同一基因型的無性系后代的不同HMW-GS編碼位點變異頻率也不相同。

4.3小麥體細胞無性系SSR位點的變異具有基因型依賴性；蛋白質和賴氨酸含量的變異幅度與SSR位點變異頻率無直接的相關性。

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Analysis of HMW-GS Composition,Protein Content, Lysine Content and SSR Allelic Variations in Wheat Somaclonal Lines

WANG Wei1,YANG Suizhuang2,YE Chunlei1,CHEN Chen1,OU Qiaoming1,WANG Hongmei1,LUO Junjie1

(1.Bio-technology Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou,Gansu 730070,China;2.College of Life Science and Engineering,Southwest University of Science and Technology,Mianyang,Sichuan 621010,China)

Abstract:In order to clarify the variations in HMW-GS subunit composition,SSR loci,and protein and lysine content in the wheat lines derived from somaclonal variation,the HMW-GS subunit composition,protein content,lysine content and SSR loci in R4 and R5 somaclonal progenies of three genotypes Ningchun 4,Longchun 21 and Huapei 9355 were determined and detected. The results indicated there were variations at all the three loci encoding HMW-GS; the variation frequency and locus in somaclonal lines of different genotypes was not identical; the variation frequency of different loci in somaclonal lines with the same genotype was also different; ultra-parent variations of protein and lysine content were found in somaclonal lines and the traits in most of the R4 generation lines could be passed on to the R5 generation; the variation of SSR locus in somaclonal lines was genotype-dependent; and there was no direct correlation between the variation frequency of protein content,lysine content and that of SSR locus in somaclonal lines. The results will further provide scientific basis for creating germplasm resource and quality breeding in wheat by taking advantage of somaclonal variation.

Key words:Wheat; Somaclonal line; Variation; Quality breeding

中圖分類號：S512.1；S330

文獻標識碼：A

文章編號：1009-1041(2016)02-0157-08

通訊作者：楊隨莊(E-mail: yangs_z@163.com); 羅俊杰(E-mail:hnsljjie@163.com)

基金項目：甘肅省自然科學基金項目(096RJZA027)；甘肅省農科院農業科技創新基金項目(2013GAAS27)；甘肅省農業生物技術研究與應用開發項目(GNSW-2014-15)；甘肅省農科院科技創新工程學科團隊項目(2014GAAS06)

收稿日期：2015-08-26修回日期：2015-09-27

網絡出版時間：2016-01-26

網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160126.1944.010.html

第一作者E-mail：haploidbreeding@163.com