原花青素對血管性認知功能障礙大鼠腦單胺類神經遞質含量的影響

蘇軍紅， 徐曉臣， 王英杰， 趙冉冉

(1邯鄲市第一醫院神經內科，邯鄲　056002； 2邯鄲市第一醫院急診科； *通訊作者，E-mail:15830404276@163.com)

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原花青素對血管性認知功能障礙大鼠腦單胺類神經遞質含量的影響

蘇軍紅1， 徐曉臣1， 王英杰1， 趙冉冉2*

(1邯鄲市第一醫院神經內科，邯鄲056002；2邯鄲市第一醫院急診科；*通訊作者，E-mail:15830404276@163.com)

摘要：目的觀察原花青素(proanthocyanidins，PAC)對血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)大鼠認知功能和腦內單胺類神經遞質和單胺氧化酶含量的影響。方法選取健康成年雄性Wistar大鼠48只，隨機分為4組：假手術組(sham)、血管性認知功能障礙組(VCI)、低劑量原花青素組(L-PAC,100 mg/kg)和高劑量原花青素組(H-PAC,200 mg/kg)。雙側頸動脈結扎術制備血管性認知功能障礙模型，造模后每天灌胃給藥，給藥容量為2 ml，共給予28 d。Morris水迷宮檢測VCI大鼠認知功能，水迷宮結束后取材，采用分光光度計檢測前腦皮層單胺氧化酶(monoamine oxidase, MAO)的含量，高效液相色譜儀法檢測大鼠前腦皮層去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)的含量。結果與sham組相比較，VCI組大鼠前腦皮層中5-HT、NE和DA的含量均顯著下降(P<0.05)，MAO含量明顯升高(P<0.05)；與VCI組相比較，低劑量和高劑量PAC治療明顯增加VCI大鼠前腦皮層中NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，減少MAO的含量(P<0.05)。結論原花青素能夠明顯提高VCI大鼠的空間學習記憶能力，能夠調節VCI大鼠腦內單胺類神經遞質系統。

關鍵詞：血管性認知功能障礙；原花青素；單胺類神經遞質

血管性認知功能障礙(vascular cognitive impairment,VCI)由心、腦血管病引起，表現為認知功能的下降，嚴重時表現為血管性癡呆。隨著人口老齡化的到來，心腦血管病的發病率呈不斷上升趨勢，醫療水平的提高使心腦血管疾病的生存率不斷升高，因此VCI病人數量迅速增長，帶來了沉重的醫療負擔。目前臨床中尚缺乏能夠改善VCI認知水平的特效藥物。目前研究認為，氧化應激參與了血管性認知功能障礙的發病過程，抗氧化劑通過減輕機體氧化應激水平，具有改善血管性認知功能障礙的作用。原花青素是優良的自由基清除劑，在體內具有強效抗氧化功能。既往已有研究發現，原花青素能夠改善阿爾茲海默模型大鼠的學習記憶功能，并顯著提高大鼠腦內抗氧化酶的活性[1]。本研究通過雙側頸總動脈結扎制備血管性認知功能障礙大鼠模型，觀察原花青素對血管性認知功能障礙大鼠前腦皮層中單胺類神經遞質、單胺氧化酶含量的影響及對認知功能的保護作用。

1材料與方法

1.1藥品和主要試劑

原花青素(proanthocyanidins,PAC)由Sigma公司提供，去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)和多巴胺(doparmine,DA)標準品均由中國生物藥品制品檢定所提供，單胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2實驗動物分組和模型制備

健康雄性Wistar大鼠48只，體重250-290 g，河北醫科大學實驗動物中心提供，隨機數字表法分為4組：假手術組(sham)、血管性認知功能障礙組(VCI)、低劑量原花青素組(L-PAC)和高劑量原花青素組(H-PAC)，每組12只。腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物后，仰臥位固定，頸前區去毛并消毒，頸前正中縱行切開皮膚及皮下組織，鈍性分離出雙側頸總動脈，套以絲線結扎近心端和遠心端，從兩個結扎點間剪斷動脈后縫合皮膚，放回籠中，嚴密觀察大鼠一般情況。假手術組僅分離雙側頸總動脈，不阻斷血流。sham組和VCI組每日灌胃2 ml生理鹽水，L-PAC組和H-PAC組給予100 mg/kg和200 mg/kg PAC灌胃相應劑量，每日1次，共28 d。

1.3Morris水迷宮試驗

于實驗第29天起行Morris水迷宮試驗，第29-33天為定位航行試驗，每日大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限順序分別從4個入水點放入水中，記錄120 s內大鼠爬上平臺花費時間為逃避潛伏期，第34天為空間探索試驗，將平臺撤去，記錄大鼠2 min內停留在平臺所在象限的時間。

1.4高效液相色譜儀分析NE、DA、5-HT含量

Morris水迷宮試驗結束后，大鼠以7%水合氯醛(0.3 ml/100 g)麻醉后，斷頭取腦，冰盤上快速分離前腦皮層組織，稱濕重，按1∶10(mg ∶μl)加入預冷的高氯酸，在冰浴中制備成10%勻漿，離心后取上清液，采用高效液相色譜儀分析各指標含量。

1.5MAO檢測

Morris水迷宮試驗結束后大鼠斷頭取腦，冰盤上快速分離前腦皮層組織，稱濕重后加冰生理鹽水制備成10%勻漿，按照試劑盒說明書進行具體實驗步驟。

1.6統計學分析

應用SPSS13.0進行統計分析，所有實驗數據以均數±標準差表示，逃避潛伏期數據應用重復測量設計的方差分析，其余數據均應用one-way ANOVA進行統計分析，兩兩比較采用SNK檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1水迷宮實驗結果

與sham組相比較，VCI組大鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，目標象限停留時間明顯縮短(P<0.05)；L-PAC組和H-PAC組分別與VCI組相比逃避潛伏期均明顯縮短(P<0.05)，目標象限停留時間明顯延長(P<0.05，見表1)。各組大鼠游泳速度無差異。

表1原花青素對Morris水迷宮成績的影響(s)

Table 1The effects of PAC on Morris water maze performance(s)

組別 逃避潛伏期Day29Day30Day31Day32Day33目標象限停留時間sham組58.21±10.2150.45±10.2831.10±9.5120.48±9.4311.37±3.6327.07±5.12VCI組66.34±13.1254.67±12.4142.71±10.59*39.52±11.70*26.46±8.41*9.39±4.81*L-PAC組59.54±11.4552.46±10.3640.61±10.84#28.34±10.47#15.31±6.01#14.93±5.21#H-PAC組61.21±13.4349.89±10.4835.18±8.2926.71±7.5913.05±2.8222.65±6.84

與sham組比較，*P<0.05；與VCI組比較，#P<0.05

2.2原花青素對前腦皮層單胺類神經遞質和MAO含量的影響

與sham組相比，VCI組大鼠前腦皮層內NE、DA和5-HT的水平明顯降低(P<0.05)，MAO的含量顯著升高(P<0.05)；低劑量原花青素組和高劑量原花青素組均能明顯緩解血管性認知功能障礙大鼠腦內單胺類神經遞質的紊亂，明顯升高NE、DA和5-HT的含量(P<0.05)，并能使MAO的含量顯著升高(P<0.05)；低劑量原花青素組NE、DA、5-HT和MAO仍未達到對照組的正常水平，高劑量原花青素組各項指標水平與sham組相比無顯著差異(見表2)。

3討論

血管性認知功能障礙可由高血壓、糖尿病、動脈粥樣硬化、吸煙等影響腦血流量等多種因素誘發[2]。VCI患者的主要臨床表現是學習和記憶功能的下降。由于VCI發病人數的上升，VCI已經成為神經科學研究的前沿和熱點。近年來的研究表明，VCI的發病機制可能是由于氧化應激、神經遞質紊亂、促炎因子的釋放等多重因素導致神經元和白質的損害所致[3-5]。動物實驗發現，雙側頸總動脈結扎術后大鼠腦內脂質過氧化和氧化性DNA損傷均明顯增加[6,7]。抗氧化有可能是血管性認知功能障礙的有效治療靶點[8]。

表2原花青素對前腦皮層NE、DA、5-HT和MAO含量的影響

Table 2Effects of PAC on levels of NE, DA, 5-HT and MAO in the forebrain cortex

組別 NE(ng/g)DA(ng/g)5-HT(ng/g)MAO[U/(h·mg)]Sham組312.11±19.53411.94±38.25433.17±31.5320.83±2.41VCI組183.27±10.81*253.51±18.90*218.51±14.66*38.21±3.73*L-PAC組 268.32±18.51*# 314.10±30.33*# 387.27±34.13*# 29.12±1.78*#H-PAC組299.80±19.56#420.20±31.28#420.33±31.48#18.38±1.39#

與sham組相比較，*P<0.05；與VCI組相比較，#P<0.05

目前研究認為[9-12]，神經遞質與學習記憶功能密切相關，膽堿能神經遞質系統的狀態與認知密切相關，中樞神經系統單胺類神經遞質在學習、記憶過程中發揮了易化作用。5-HT是重要的單胺類神經遞質，與睡眠、情感、學習、記憶功能密切相關。單胺類神經遞質的合成、釋放是學習、記憶功能正常的基礎。腦內單胺類神經遞質含量的下降是認知功能受損的典型特點[10]。此外，有研究發現，5-HT再攝取抑制劑藥物能有效改善動物在Morris水迷宮中的表現，表明調節中樞神經系統單胺類神經遞質含量具有改善認知功能的作用[11]。

原花青素(PAC)是天然存在的多酚類化合物，廣泛存在于植物中，尤以葡萄籽中含量最高。PAC具有極強的抗氧化能力，也可清除體內的活性氧自由基，其抗氧化能力是維生素的50倍。大量研究表明，PAC通過抗氧化能力具有神經保護和抗衰老作用。既往研究證實，原花青素能夠改善阿爾茨海默和血管性癡呆大鼠的認知功能[13]，但其具體機制還未明確。

本研究表明，通過雙側頸總動脈結扎術后，大鼠學習、記憶能力明顯下降，血管性認知功能障礙模型建立成功，原花青素干預4周后大鼠認知功能得到明顯的改善，且改善作用與劑量相關；進一步檢測大鼠皮前腦層中單胺類神經遞質含量發現，VCI大鼠DA、NE和5-HT的含量均有明顯下降，MAO含量顯著升高，而原花青素干預4周后可減輕改善單胺類神經遞質失衡。證實PAC具有保護VCI大鼠學習、記憶功能的作用，同時PAC能夠調節前腦皮層中單胺類神經遞質含量。然而，PAC究竟是通過何種機制調節了單胺類神經遞質的含量，還有待進一步研究。

總的來說，原花青素在血管性認知功能障礙大鼠模型中，具有保護認知功能的作用，而且能夠調節前腦皮層中單胺類神經遞質含量。本研究為血管性認知功能的臨床治療提供了理論依據。原花青素有可能成為治療血管性認知功能障礙的有效藥物，還需進一步的研究以驗證其治療作用。

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Effects of proanthocyanidins on monoamine transmitters in vascular cognitive impairment rats

SU Junhong1, XU Xiaochen1, WANG Yingjie1, ZHAO Ranran2*

(1DepartmentofNeurology,FirstHospitalofHandan,Handan056002，China;2DepartmentofEmergency,FirstHospitalofHandan;*Correspondingauthor,E-mail:15830404276@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the effects of proanthocyanidins(PAC) on the contents of monoamine neurotransmitters and monoamine oxidase(MAO) in vascular cognitive impairment rats.MethodsForty-eight healthy adult male Wistar rats were randomly assigned into four groups: sham group, VCI group, low-dose PAC group and high-dose PAC group. Bilateral common carotid arteries were occluded in healthy adult male Wistar rats to establish VCI model. Morris water maze was used to evaluate spacial learning and memory function. MAO was measured spectrophotometrically, and the levels of norepinephrine(NE), doparmine(DA) and 5-HT in the forebrain cortex were detected by HPLC.ResultsCompared to sham group, the contents of NE, DA and 5-HT significantly decreased in VCI group(P<0.05), while MAO significantly increased(P<0.05). Compared with VCI group, NE, DA and 5-HT significantly increased in both low-dose PAC group and high-dose PAC group(P<0.05), while MAO decreased(P<0.05).ConclusionPAC could significantly improve spacial learning and memory abilities, and restore central monoamine neurotransmitters system.

Key words:vascular cognitive impariment;proanthocyanidins;monoamine transmitter

[收稿日期：2015-10-24]

作者簡介：蘇軍紅，女，1971-12生，本科，副主任醫師.

中圖分類號：R742

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)02-0124-03

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.02.005

基金項目：邯鄲市科學技術研究與發展計劃資助項目(1523108138)