17-β-雌二醇對人肝細胞癌細胞MHCC97H侵襲轉移的作用及其機制

鄒三鵬， 沙煥臣 (廣東醫學院附屬惠東醫院腫瘤內科，惠州　56300； 西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科；通訊作者，E-mail: shahuanchen9@63.com)

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17-β-雌二醇對人肝細胞癌細胞MHCC97H侵襲轉移的作用及其機制

鄒三鵬1， 沙煥臣2*(1廣東醫學院附屬惠東醫院腫瘤內科，惠州516300；2西安交通大學第一附屬醫院肝膽外科；*通訊作者，E-mail: shahuanchen229@163.com)

摘要：目的觀察17-β-雌二醇對人MHCC97H肝癌細胞侵襲轉移的作用，探討其相應機制。方法用不同濃度17-β-雌二醇(0，0.1，1，10 μmol/L)干預MHCC97H肝癌細胞24 h。Transwell小室法檢測17-β-雌二醇干預后MHCC97H肝癌細胞侵襲能力的改變。利用real-time PCR和Western blot法檢測17-β-雌二醇干預對MHCC97H肝癌細胞中E-cadherin和Vimentin RNA和蛋白表達水平的改變。Western blot檢測17-β-雌二醇對MHCC97H細胞中Smad2和p-Smad2蛋白表達水平的影響。結果17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細胞的侵襲能力，隨著濃度的升高抑制能力逐漸增強(P<0.05)。當濃度超過0.1 μmol/L 時，17-β-雌二醇能夠有效抑提高MHCC97H肝癌細胞中E-cadherin的轉錄和蛋白表達，并同時抑制細胞中Vimentin蛋白的表達(P<0.05)；當濃度超過0.2 μmol/L 時，17-β-雌二醇能夠有效抑制Vimentin的轉錄(P<0.05)。進一步的檢測發現當濃度超過0.1 μmol/L 時，17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H細胞中Smad2的磷酸化水平(P<0.05)。結論17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細胞的侵襲，這種作用可能與其通過抑制Smad2的磷酸化進一步調節E-cadherin和Vimentin的表達有關。

關鍵詞：17-β-雌二醇；肝細胞癌；MHCC97H細胞；細胞侵襲；Smad 2;E-cadherin;Vimentin

肝細胞癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，具有高死亡率和治療手段有限的特點。流行病學調查顯示，肝癌在男性中的發病率明顯高于女性[1]。同時又有研究發現，在從慢性肝病向肝癌發展的過程中男性患者的進展速度也明顯快于女性，且預后較差[2]，男性慢性肝病患者發生肝癌的風險是女性患者的3-5倍，在用嚙齒類動物構建的肝癌模型中，雄性動物發生肝癌的風險明顯高于雌性。關于雄激素的研究發現，雄性激素能夠誘導并加快肝癌的發展進程[3]，異常的雄性激素的代謝改變也與肝癌的發生相關[4]。侵襲轉移是造成肝癌患者術后復發、治療失敗和死亡的主要原因[1-3]，抗肝癌侵襲轉移新藥的開發意義重大，是延長肝癌患者生存期、提高遠期療效的重要措施。但至今仍缺乏有效的防治手段。關于17-β-雌二醇與肝癌關系，當前的研究還沒有得到一致的結論[3,5-9]。基于以上本研究擬探討17-β-雌二醇與肝癌侵襲轉移的關系，并進一步探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1材料

人高侵襲性MHCC97H肝癌細胞株購于上海市復旦大學肝癌研究所。DMEM和胎牛血清購自Sigma 公司，相關引物由TaKaRa公司合成構建。Smad 2和p-Smad2購于Cellsignal公司，E-cadherin 和Vimentin 抗體購于Abcam公司，beta-actin購自Santa-Crus公司。17-β-雌二醇(Estradiol)為Sigma公司產品，RT-PCR試劑均購自RT-PCR公司。

1.2細胞培養與干預

MHCC97H肝癌細胞購于上海市復旦大學肝癌研究所，使用含有100 ml/L胎牛血清的DMEM培養基培養，當細胞融合率達到70%-80%時進行傳代，傳代間隔約為2-3 d。17-β-雌二醇利用二甲基亞砜(DMSO)溶解，DMSO的最終濃度<0.1%，其后用PBS稀釋至工作濃度。待MHCC97H細胞長到融合后，PBS洗滌3次，加入無血清DMEM培養基培養24 h，其后按照實驗要求加入相應濃度17-β-雌二醇和含有相應濃度DMSO的PBS(對照)。17-β-雌二醇的濃度均為0,0.1,1,10 μmol/L，處理時間為24 h。其后提取總RNA和蛋白進行real time PCR和免疫印跡分析。

1.3細胞侵襲試驗

取對數生長期MHCC97H肝癌細胞，胰酶常規消化后利用含有20 ml/L血清濃度的培養基制成5×105細胞/ml的細胞懸液，在Tranwell小室上室中加入含有不同濃度17-β-雌二醇的細胞懸液0.5 ml，下室中加入1 ml血清濃度為100 ml/L的常規培養基。培養24 h，然后取出小室對細胞進行固定，用棉簽去除上室中殘留細胞并對小室底部的細胞進行固定、染色和拍照，并在顯微鏡下進行計數。

1.4實時定量PCR檢測苦參堿對E-cadherin 和Vimentin轉錄的影響

Trizol法提取各組細胞中總RNA，根據TaKaRa公司PrimeScript RT-PCR Kit試劑說明書進行反轉錄cDNA。以cDNA為模板進行real-time PCR反應并對結果進行分析，引物設計：E-cadherin為5′-TACACTGCCCAGGAGCCAGA-3′和3′-TGGCACCAGTGTCCGGATTA-5′，Vimentin 為5′-TGAGTACCGGAGACAGGTGCAG-3′和3′-TAGCAGCTTCAACGGCAAAGTTC-5′，β-actin 為5′-CCATCGTCCACCGCAAAT-3′和3′-CATGCCAATCTCATCTTGTTT-5′。

1.5免疫印跡試驗

17-β-雌二醇處理MHCC97H肝癌細胞24 h，常規消化細胞后冰PBS洗滌2次，加入裂解液裂解細胞，離心提取細胞總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，并根據蛋白提取物濃度確定上樣量。每次試驗之前將蛋白煮沸變性、然后在SDS凝膠中每孔加入等量蛋白，根據目的蛋白的分子量調整電泳時間和電壓，電泳結束后轉膜，將PVDF膜置于在50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。根據抗體說明書配置一抗濃度，然后將膜封閉于含有各種抗體的溶液中，4 ℃搖床過夜。次日PBST洗膜3次，然后常溫封閉相應二抗1 h、再次用PBST洗滌3次，最后一次用PBS洗滌，洗滌時間均為15 min。最后利用成像系統對結果圖像進行采集，并對數據進行分析。

1.6統計學分析

2結果

2.117-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細胞侵襲的影響

MHCC97H肝癌細胞的侵襲能力較強，對照組培養24 h，穿過基質膠到達小室底端的細胞較多。在17-β-雌二醇干預后，MHCC97H肝癌細胞的侵襲能力受到明顯抑制，穿過基質膠到達小室底端的肝癌細胞數量明顯減少，隨著17-β-雌二醇濃度的增加，穿過基質膠到達小室底端的MHCC97H肝癌細胞的數目逐漸減少(見圖1A)，0.1，1，10 μmol/L濃度組MHCC97H肝癌細胞穿過基質膠到達小室底端的細胞數目，分別為對照組的(70.11±9.11)%、(49.34±10.52)%和(43.32±14.63)%，具有明顯的劑量效應關系(P<0.05，見圖1B)。

2.217-β-雌二醇對E-cadherin和Vimentin的轉錄水平的影響

為了進一步檢測17-β-雌二醇抑制MHCC97H肝癌細胞侵襲轉移的機制，我們利用real-time PCR技術檢測了17-β-雌二醇對E-cadherin和Vimentin mRNA轉錄水平的影響，結果發現17-β-雌二醇能夠在RNA水平明顯抑制Vimentin的轉錄，同時能夠有效增強E-cadherin的轉錄差異具有統計學意義(P<0.05，見圖2)。在17-β-雌二醇作用后，E-cadherin的表達水平逐漸降低，而Vimentin的表達水平逐漸升高。

2.317-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細胞中E-cadherin和N-cadherin表達的影響

E-cadherin和Vimentin在肝癌的侵襲轉移過程中發揮重要作用。在17-β-雌二醇干預后，MHCC97H肝癌細胞中，Vimentin的蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，而E-cadherin的蛋白表達水平逐漸升高(P<0.05)，差異均具有統計學意義(見圖3)。

圖1　不同濃度17-β-雌二醇對MHCC97H細胞侵襲轉移能力的影響 Figure 1　The inhibition effect of 17-β-oestrogen on the invasion of MHCC97H cells

與對照組(0 μmol/L)比較,**P<0.01圖2　17-β-雌二醇對MHCC97H細胞中E-cadherin和Vimentin轉錄水平的影響Figure 2　The effect of 17-β-oestrogen on the expression of E-cadherin and Vimentin in HeLa cells

2.417-β-雌二醇對MHCC97H肝癌細胞中Smad2和p-Smad2的影響

Smad2的磷酸化水平的改變，能夠通過調節上皮間質轉化過程，調節腫瘤細胞的侵襲轉移。我們的結果顯示，在17-β-雌二醇作用后Smad2的磷酸化水平明顯降低，0.1 μmol/L組、1 μmol/L組和10 μmol/L組分別為對照組的(81.92±23.94)%、(65.38±22.39)%和(47.06±1.47)%，差異具有統計學意義(P<0.05，見圖4)。

圖3　不同濃度17-β-雌二醇對MHCC97H細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平的影響Figure 3　The inhibition effect of 17-β-oestrogen on the expression of E-cadherin and Vimentin of protein level in MHCC97H cells

3討論

關于17-β-雌二醇在肝癌發生發展過程中作用至今尚未有定論，但是流行病學調查顯示，肝癌在男性患者中的發病率明顯較高且預后較差。而侵襲轉移是造成肝癌患者死亡主要原因，所以明確17-β-雌二醇在肝癌細胞侵襲轉移過程的作用具有重要的理論價值和社會意義。我們的研究結果顯示，17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細胞的體外遷移和侵襲能力，提示17-β-雌二醇在肝癌的侵襲轉移過程中發揮重要作用。

圖4　不同濃度17-β-雌二醇對Smad2和p-Smad2表達的影響 Figure 4　The effect of 17-β-oestrogen on the expression of Smad2 and p-Smad2

近年來研究發現，上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與多種腫瘤密切相關，在肝癌等多種癌癥的原位浸潤和遠處轉移中發揮重要作用[4]。此外,EMT在肝癌的發生發展過程中發揮極為重要的作用，在肝炎病毒感染階段，病毒的感染會導致正常肝細胞通過EMT轉化為成纖維細胞等能夠促進肝纖維化的細胞，從而引起肝纖維化和肝硬化。同時病毒合成的蛋白還能夠通過上調TGF-β相關信號通路的活性，促進EMT的發生從而使得肝細胞變成無限增殖的腫瘤細胞成為可能[5]。在肝癌發生的早期，許多肝癌細胞能夠通過EMT獲得較強的侵襲能力，從而從原發腫瘤脫離發生侵襲轉移，這也是肝癌患者容易發生早期轉移的重要原因之一[6]。研究發現EMT在肝癌早期播散過程中發揮重要作用，而twist和vimentin可以作為肝癌發生侵襲轉移的早期診斷指標[7]。最近的研究發現vimentin高表達和E-cadherin低表達與肝癌的惡性特征相關，該研究還認為E-cadherin可以作為判斷肝癌預后的一個獨立指標[8]。通過對肝癌患者的標本檢測發現，E-cadherin低表達與肝癌患者的預后較差相關[9]。總之,EMT在肝癌發生發展的整個過程中均發揮重要作用，在肝癌細胞發生EMT的過程中，肝癌細胞會發生上皮標記的丟失(E-cadherin)及間質標記的獲得(N-cadherin 和 Vimentin等)。其中E-cadherin的丟失或者破壞是EMT進程的標志[4,10]。Vimentin是EMT的一個重要間質標記，是間質細胞遷徙的重要調節者之一。在關于乳腺癌的研究中發現，Vimentin在Slug誘導的乳腺癌EMT進程中發揮重要作用[11]。而作為EMT過程中重要的間質標記，N-cadherin在腫瘤細胞EMT及腫瘤細胞EMT相關的化療耐藥發揮重要作用[12,13]。本研究的結果顯示，17-β-雌二醇能夠有效抑制Vimentin的表達，同時提高E-cadherind的表達，提示17-β-雌二醇對肝癌細胞侵襲轉移的抑制作用可能與其對肝癌細胞EMT進程的調節作用相關。

TGF-β1是TGF中的一類，是EMT發生的一個重要的誘導因子，已經證實，在多種高表達TGF-β1的腫瘤中，TGF-β1可以自分泌和旁分泌的形式作用于腫瘤細胞，與腫瘤細胞表面的TGF-β2受體結合，其后TGF-β2受體通過直接磷酸化的方式活化TGF-β1受體，其后細胞內Smad2 和 Smad3受體發生磷酸化，然后與Smad4形成三聚體入核調節EMT相關基因的表達，從而誘導和維持細胞EMT[14]。我們的研究發現，17-β-雌二醇能夠抑制Smad2的磷酸化，提示其對E-cadherin和Vimentin的調節作用可能與其對TGF/Smad信號通路的調節作用相關。

綜上所述，我們的研究發現17-β-雌二醇能夠有效抑制MHCC97H肝癌細胞的侵襲轉移，而這種作用可能是通過調節TGF/Smad信號通路的活性進一步調節E-cadherin和Vimentin的表達來實現的。我們的研究結果為進一步明確17-β-雌二醇在肝癌發生發展中的作用提供了新的實驗依據。

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Effect of 17-β-oestrogen on invasion of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H cells and its mechanism

ZOU Sanpeng1， SHA Huanchen2*

(1DepartmentofOncology,AffiliatedHuidongHospitalofGuangdongMedicalCollege,Huizhou516300,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity；*Correspondingauthor,E-mail:shahuanchen229@163.com)

Abstract：ObjectiveTo explore the anti-metastatic effect of oestrogen on invasion of human hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H cells and its possible mechanism.MethodsMHCC97H cells were treated with different concentrations of oestrogen(0, 0.1,1,10 μmol/L)for 24 h. The inhibitory effects of oestrogen on the migration and invasion of MHCC97H cells were measured by Transwell assay. Moreover, real time PCR and Western blot were used for investigating the expression of E-cadherin, Vimentin, Smad 2 and p-Smad 2.ResultsThe 17-β-oestrogen significantly inhibited the migration and invasion of MHCC97H cells in a dose-dependent manner(P<0.05). When the concentration was above 0.1 μmol/L, 17-β-oestrogen significantly down-regulated protein expression of Vimentin, the phosphorylation level of Smad 2, and up-regulated the RNA and protein levels of E-cadheirn(P<0.05). When the concentration was above 0.2 μmol/L, 17-β-oestrogen significantly down-regulated RNA level of Vimentin(P<0.05).ConclusionThe results suggest that oestrogen may effectively inhibit the epithelial-mesenchymal transition(EMT) of HCC, which may be related to the regulation of E-cadherin and Vimentin in MHCC97H cells through inhibiting the phosphorylation of Smad 2.

Key words:17-β- oestrogen;hepatocellular carcinoma;MHCC97H cells;cell invasion;Smad 2;E-cadherin;Vimentin

[收稿日期：2015-10-12]

作者簡介：鄒三鵬，男， 1969-10生，博士，副主任醫師，E-mail：zspdoctor@163.com.

中圖分類號：R735.7

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0014-05

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.004