高效液相色譜法測定克痤隱酮凝膠中丹參酮粉含量

蔡麗娟，臧恒昌

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南　250012；2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽 合肥　230088)

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高效液相色譜法測定克痤隱酮凝膠中丹參酮粉含量

蔡麗娟1,2，臧恒昌1

(1.山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南250012；2.合肥立方制藥股份有限公司，安徽 合肥230088)

摘要：目的建立高效液相色譜法同時測定丹參酮ⅡA與隱丹參酮的檢驗方法，以評價克痤隱酮凝膠中丹參酮粉的含量。方法采用C(18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：甲醇—水(85∶15)；流速：1.0 mL·min(-1)；檢測波長：254 nm。結(jié)果丹參酮ⅡA在5.04～100.80 mg·L(-1)的濃度范圍內(nèi)，峰面積A與濃度C呈良好的線性關(guān)系r=1.00，回收率為98.37%，RSD=0.45%(n=6)；隱丹參酮在濃度5.04～100.87 mg·L(-1)的范圍內(nèi)，峰面積 A與濃度C呈良好的線性關(guān)系r=1.00，回收率為98.43%，RSD=0.41%(n=6)。結(jié)論該方法簡便、準確、重現(xiàn)性好，可用于克痤隱酮凝膠中丹參酮粉含量測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；克痤隱酮凝膠；丹參酮ⅡA；隱丹參酮

克痤隱酮凝膠是以中藥為主的中西藥復(fù)方制劑，其組方為丹參酮粉、維生素E、維生素A、甲氧芐啶，臨床上主要用于抑制皮脂腺分泌及痤瘡桿菌生長。其中主要成分丹參酮具有溫和的雌激素的活性，同時對革蘭陽性菌和痤瘡棒狀桿菌有較明顯的抑制作用，還有顯著的抗炎作用，對痤瘡的驗證反應(yīng)切實有效[1-4]。本文通過查閱相關(guān)文獻[5]，建立高效液相色譜法同時測定丹參酮ⅡA與隱丹參酮的檢驗方法，來評價克痤隱酮凝膠中丹參酮粉的含量。

1儀器和試劑

1.1儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀、島津SPD-20A檢測器,GL sciences(250 mm×4.6 mm，5 μm)C18色譜柱，LC solution工作站，梅特勒-托利多XS205電子天平。

1.2試劑甲醇為色譜純(Sigma)、水為高純水(合肥立方制藥股份有限公司自制)、乙醚為分析純(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；丹參酮ⅡA對照品、隱丹參酮對照品(中國藥品生物制品檢定所)；克痤隱酮凝膠(合肥立方制藥股份有限公司，批號：20140101、20140501、20140601、20140602)。

2方法與結(jié)果

2.1檢測方法

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇—水(85∶15)為流動相；檢測波長為254 nm；理論板數(shù)按丹參酮ⅡA 峰計算應(yīng)不低于2 000，按隱丹參酮峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.1.2對照品溶液的制備取丹參酮ⅡA對照品 0.5 mg，隱丹參酮對照品 0.5 mg，精密稱定，置10 mL棕色量瓶中，用甲醇超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3供試品溶液的制備取本品 5 g，精密稱定，加層析用硅膠(100～200目)10 g，拌勻，用乙醚濕法裝入色譜柱(內(nèi)徑2.5 cm)上，用乙醚洗脫至色譜柱無色為止，收集乙醚洗脫液，揮干，殘渣加甲醇使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2專屬性實驗

2.2.1溶液的制備(1) 丹參酮ⅡA對照品溶液：取丹參酮ⅡA對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成 50 mg·L-1的溶液，搖勻；(2)隱丹參酮對照品溶液：取隱丹參酮對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成50 mg·L-1的溶液，搖勻，再精密量取5.0 mL，置10 mL棕色量瓶中，搖勻，即得；(3)混合對照溶液：取丹參酮ⅡA對照品、隱丹參酮對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解并定量稀釋制成50 mg·L-1的溶液，搖勻，即得；(4)供試品溶液：取本品5 g，精密稱定，加層析用硅膠(100～200目)10 g，拌勻，用乙醚濕法裝入色譜柱(內(nèi)徑2.5 cm)中，用乙醚洗脫至色譜柱無色為止，收集乙醚洗脫液，揮干，殘渣加甲醇使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得；(5)空白輔料溶液：取處方配比量的空白輔料(去除丹參酮粉)5 g，照供試品溶液制備方法處理，即得。

2.2.2檢驗結(jié)果如圖1～5所示，空白試驗溶劑和空白輔料在主峰處無明顯吸收，即空白試驗溶劑和空白輔料不干擾含量檢測。隱丹參酮保留時間約為8 min，丹參酮ⅡA保留時間約為12 min。樣品中丹參酮ⅡA 峰理論塔板數(shù)為7 813，隱丹參酮峰理論塔板數(shù)為6 305，符合要求。

圖1　丹參酮ⅡA對照品溶液

圖2　隱丹參酮對照品溶液

圖3　混合對照品溶液

圖4　供試品溶液

圖5　空白輔料溶液

2.3線性與范圍精密稱取隱丹參酮對照品 10.22 mg，丹參酮ⅡA對照品10.08 mg，置同一個100 mL棕色量瓶中，用甲醇超聲溶解，并稀釋至刻度，作為儲備液。精密量取儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mL分別至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別取峰面積對濃度做線性方程，丹參酮ⅡA：線性方程為：A=48 025.45C-1 015.93, 相關(guān)系數(shù)r=1.00;隱丹參酮：線性方程為：A=41 263.59C+6 631.63, 相關(guān)系數(shù)r=1.00;丹參酮ⅡA在5.04～100.80 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，隱丹參酮在濃度5.04～100.87 mg·L-1的范圍內(nèi)，峰面積A與濃度C呈良好的線性關(guān)系。

2.4儀器精密度試驗精密量取“2.3”項下儲備液5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，丹參酮ⅡA的峰面積的RSD為0.13%；隱丹參酮的峰面積的RSD為0.13%，儀器精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗取“2.4”項下溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h時，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗結(jié)果，對照品溶液放置24 h后，丹參酮ⅡA的峰面積的RSD為0.22%，隱丹參酮峰面積的RSD為0.21%，表明對照品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6定量限和檢測限試驗按信噪比為10∶1，測定本方法的定量限，按信噪比為3∶1測定本方法檢測限。精密量取“2.3”項下儲備液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取4.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為定量限溶液。

精密量取定量限溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6針，記錄色譜圖。結(jié)果：丹參酮ⅡA定量限溶液連續(xù)進樣6針，峰面積和保留時間的RSD分別為3.23%和0.12%，丹參酮ⅡA的定量限為0.202 ng；隱丹參酮定量限溶液連續(xù)進樣6針，峰面積和保留時間的RSD分別為4.67%和0.09%，隱丹參酮的定量限為0.202 ng。

精密量取“2.3”項下儲備液0.5 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取1.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取5.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取3.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為檢測限溶液。

精密量取檢測限溶液10 μL，注入液相色譜儀，信噪比大于3∶1，可知丹參酮ⅡA的檢測限為0.076 ng，隱丹參酮的檢測限為0.077 ng。

2.7回收率試驗精密稱取隱丹參酮對照品10.45 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為隱丹參酮對照品儲備液。再精密稱取丹參酮ⅡA10.13 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為丹參酮ⅡA對照品儲備液。

對照品溶液：精密量取隱丹參酮儲備液2.5 mL和丹參酮ⅡA儲備液2.5 mL，置同一個10 mL量瓶中，加甲醇稀釋到刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：精密稱取已知含量的克痤隱酮凝膠樣品6份，分別加入上述隱丹參酮對照品儲備液3.0 mL和丹參酮ⅡA對照品儲備液1.5 mL，加層析用硅膠(100～200目)10 g，拌勻，用乙醚濕法裝入色譜柱(內(nèi)徑2.5 cm)中，用乙醚洗脫至色譜柱無色為止，收集乙醚洗脫液，揮干，殘渣加甲醇使溶解，并定量轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

精密量取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，試驗結(jié)果見表1,2。由試驗結(jié)果可知，丹參酮ⅡA的平均回收率為98.37%，RSD為0.45%；隱丹參酮的平均回收率為98.43%，RSD為0.31%，說明本法的準確度良好,見表1，2。

表1　丹參酮ⅡA回收率試驗測定結(jié)果

表2　隱丹參酮回收率試驗測定結(jié)果

2.8重復(fù)性對照品溶液：精密量取“2.7”項下隱丹參酮對照品儲備液和丹參酮ⅡA對照品儲備液各2.5 mL，置同一個10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液：取20140101批樣品5 g，精密稱定，加層析用硅膠(100～200目)10 g，拌勻，用乙醚濕法裝入色譜柱(內(nèi)徑2.5 cm)中，用乙醚洗脫至色譜柱無色為止，收集乙醚洗脫液，揮干，殘渣加甲醇使溶解，定量轉(zhuǎn)移至10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，平行制備6份供試品。

精密量取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果：平行測定 6個樣，丹參酮ⅡA含量的RSD為0.70%；隱丹參酮含量的RSD為0.60%，說明本方法重復(fù)性良好。

2.9中間精密度取20140101批樣品，照“重復(fù)性”項下操作，由不同人于不同天配制相同濃度的供試品溶液和對照品溶液，并由該操作者進樣分析。按擬定的方法，測定供試品中丹參酮ⅡA或隱丹參酮的含量。結(jié)果：不同天、不同人測得的12個樣品中丹參酮ⅡA含量的 RSD為1.14%，隱丹參酮含量的RSD為0.68%，中間精密度良好。

2.10耐用性取20140101批樣品，按擬定的方法,通過改變不同波長、流速、流動相比例、不同色譜柱、不同硅膠量，測定同一樣品中丹參酮ⅡA或隱丹參酮的含量。試驗結(jié)果見表3。由試驗結(jié)果可知，改變波長、流速、流動相比例、色譜柱和層析用硅膠的量，丹參酮ⅡA的含量檢測結(jié)果基本一致，隱丹參酮的含量測定結(jié)果也基本一致，說明該方法的耐用性較好。

表3　丹參酮粉含量測定耐用性試驗測定結(jié)果/mg·g-1

2.11樣品測定取本廠生產(chǎn)的克痤隱酮凝膠三批樣品(批號： 20140501、20140601、20140602)，對隱丹參酮和丹參酮ⅡA分別進行含量測定，結(jié)果見表4。結(jié)果可知連續(xù)生產(chǎn)的樣品檢驗結(jié)果重現(xiàn)性較好，產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定。

表4　三批樣品丹參酮粉含量測定結(jié)果/mg·g-1

3討論

3.1關(guān)于流動相的選擇在流動相的選擇中，參考相關(guān)的文獻[5-9]，經(jīng)試驗摸索，不斷調(diào)整流動相的比例，使各色譜峰達到良好的分離效果，并能夠節(jié)約進樣時間，最終確定甲醇—水(85∶15)為最佳流動相條件。

3.2關(guān)于提取溶劑的選擇在提取溶劑的選擇中，參考相關(guān)的文獻[5,10-13]，分別考察了甲醇、乙醚、無水乙醇∶氯仿(4∶1)3種溶劑，其中甲醇提取的檢測回收率最低，乙醚與無水乙醇∶氯仿(4∶1)提取回收率差不多，但是乙醚揮干的速度最快，最終選用乙醚作為提取溶劑。

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HPLC determination of tanshinone powder in Kecuoyintong gel

CAI Li-juan1,2, ZANG Heng-chang1

(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250012,China；2.HefeiLifeonPharmaceuticalCo.,Ltd.,Hefei,Anhui230088,China)

Abstract:Objective To establish an HPLC method for the determination of tanshinone ⅡA and cryptotanshinone,thereby evaluating tanshinone powder in Kecuoyintong gel .Methods HPLC conditions: C(18) chromatographic column (250 mm×4.6 mm,5 μm); mobile phase：methanol-water (85∶15); flow rate: 1.0 mL·min(-1); wavelength:254 nm. Results For tanshinone ⅡA,in the concentration range of 5.04～100.80 mg·L(-1), the concentration C and peak area A showed a good linearity relationship(r=1.00),and the recovery rate was 98.7% (RSD=0.45%,n=6).For cryptotanshinone,in the concentration range of 5.04～100.87 mg·L(-1),the concentration C and peak area A showed a good linearity relationship(r=1.00),and the recovery rate was 98.43% (RSD=0.41%, n=6).Conclusions This method is sensitive，accurate and rapid,which can be used for quality control of content determination of tanshinone ⅡA andcryptotanshinone in Kecuoyintong gel.

Key words:HPLC;Kecuoyintong gel;tanshinone ⅡA;cryptotanshinone

(收稿日期：2015-02-10，修回日期：2016-01-15)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.04.011

作者簡介:蔡麗娟，女，碩士研究生通信作者: 臧恒昌，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：多糖類藥物研究、藥品生產(chǎn)工藝優(yōu)化及在線過程分析與過程控制， E-mail:zanghcw@126.com