雞源沙門氏菌中磺胺類藥物耐藥基因的檢測*

薛原，王曉菲，牛鑫鑫，廖聰，孫穎,田麗紅

(東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江哈爾濱150040)

雞源沙門氏菌中磺胺類藥物耐藥基因的檢測*

薛原，王曉菲，牛鑫鑫，廖聰，孫穎,田麗紅

(東北林業大學野生動物資源學院，黑龍江哈爾濱150040)

采用K-B法檢測35株黑龍江省雞源沙門氏菌對磺胺類藥物的耐藥基因。根據耐藥基因的流行情況，指導臨床合理用藥。結果表明，35株雞源沙門氏菌對sulⅠ基因的陽性率為100%，sulⅡ基因的陽性率為68.6%，sulⅢ基因的陽性率為94.3%。

沙門氏菌；磺胺類藥物；sulⅠ基因；sulⅡ基因；sulⅢ基因

隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌耐藥性很快出現。遏制沙門氏菌耐藥性的傳播和蔓延，防止沙門氏菌耐藥菌株傳播給人類已經成為世界關注的焦點?；前奉愃幬锸且活惞爬系幕瘜W合成抗菌藥物，它們至今仍廣泛用于細菌、原生動物和真菌的感染，具有抗菌譜廣和價廉易得等特點[1]?；前奉愃幬锸嵌淙~酸合成酶的競爭性抑制劑。這個酶是葉酸合成的關鍵性酶。由于磺胺類的濫用導致大量耐藥菌株的出現，這給臨床治療帶來很大困難?？刮⑸锼幾鳛榇偕L劑在食源性動物中的廣泛應用產生的抗菌藥選擇壓力，促進了微生物耐藥性的出現和傳播。許多編碼耐藥性的基因可在動物和人類病原菌間水平傳播，危害養殖業和人類健康。因此對沙門氏菌的耐藥性檢測在獸醫和公共衛生上具有十分重要的意義。

在雞沙門氏菌耐藥基因的研究方面有相關報道[2-4]，但是我國大多停留在耐藥表型上的研究[5-6]。本研究對35株雞源沙門氏菌進行的磺胺類藥物的耐藥基因進行了擴增，比較了細菌的耐藥性和耐藥基因之間的關系。

1 材料

1.1 菌株質控菌:大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所；臨床菌株：來源于黑龍江省養殖場。

1.2 儀器和試劑質粒小量提取試劑盒、Taq酶寶生物工程(大連)有限公司產品；凝膠成相分析系統，美國Alpha Imager2200公司產品；PCR儀，德國Biometra公司產品。

2 方法

2.1 藥敏試驗將經鑒定的菌株接種到營養肉湯，振蕩培養，在MH平板上涂抹均勻，用K-B瓊脂擴散法進行藥敏試驗，置于37℃培養18h。抑菌圈直徑解釋標準參照美國國家臨床實驗室標準委員會的標準，每次試驗均以大腸桿菌ATCC25922作為質控菌株。

2.2 耐藥基因檢測PCR擴增的模板為菌株質粒DNA和菌落。引物序列引自參考文獻[2]，由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，sulⅠ基因目的片段為425bp，sulⅡ基因目的片段為435bp，sulⅢ基因目的片段為792bp。

3 結果

3.1 藥敏試驗結果35株菌對磺胺類藥物復方新諾明的耐藥率為72%。

3.2 耐藥基因檢測結果以35株臨床分離的雞源沙門氏菌的質粒DNA為模板進行sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因的檢測。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因檢測結果顯示：sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR擴增陽性，其擴增片段大小與預期目的片段相符。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR檢測電泳結果見圖1、2、3。35株雞源大腸桿菌中，sulⅠ基因檢出的陽性例數為35例，陽性率為100%；sulⅡ基因檢出的陽性例數為24例，陽性率為68.6%；sulⅢ檢出的陽性例數為33例，陽性率為94.3%。

圖1 sulⅠ基因PCR擴增結果

圖2 sulⅡ基因PCR擴增結果

圖3 sulⅢ基因PCR擴增結果

4 討論

沙門氏菌是一種廣泛分布的食源性病原體，是嚴重危害人類健康和畜牧業發展的一類人畜共患病原菌。它寄生于人和動物的腸道內，在動物與人之間可通過直接或間接的途徑進行傳播，不需要中間宿主。不同國家和地區的養殖場由于其臨床用藥習慣、飼養管理水平、衛生條件及自然環境存在差異，因此致病性沙門氏菌的耐藥表型特征也不相同。

抗微生物藥應用幾十年來，確實減少了動物的發病率和死亡率，提高了經濟效益，但是在動物生產中，人們應慎用抗微生物藥，以免為了一時的經濟效益而威脅到人類自身的安全，從而付出更大的代價。沙門氏菌的耐藥性可通過基因突變、外排泵、耐藥基因編碼的鈍化酶和滅活酶產生、可移動的細菌遺傳耐藥基因元件產生及其轉移等多種機制產生和傳遞，影響畜牧業生產和公共衛生安全。細菌對磺胺類藥物容易產生耐藥性，產生的原因是細菌產生了較多的PABA，或二氫葉酸合成酶結構改變，或者直接利用外源性葉酸。各磺胺類藥之間可產生不同程度的交叉耐藥。

臨床上的革蘭氏陰性腸道菌對磺胺類藥物的抗性很大程度是經質粒介導的，主要是由于出現替代性的、對磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶，即有抗性的DHPS。在革蘭氏陰性腸道菌中，目前的研究共有兩種具有對磺胺類藥物抗性的二氫葉酸合成酶，其基因分別命名為sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ。Swedberg等人研究了兩個由質粒介導的酶，這兩個基因的序列被檢測出來，分別命為: sulⅠ、sulⅡ[7]。sulⅢ基因同sulⅠ基因和sulⅡ基因相比，只有40%和43.3%的同源率。沙門氏菌對磺胺類產生耐藥性，除了以上出現由質粒介導對磺胺親和力更低的二氫葉酸合成酶外，其它一些試驗證明在染色體上的二氫葉酸合成酶的dhps基因經過突變，使二氫葉酸合成酶降低對磺胺類藥的親和力，從而產生抗性。

本研究的耐藥基因檢測結果表明，雞源沙門氏菌磺胺類藥物的耐藥性已經相當嚴重，必須從細菌耐藥性產生的分子機理方面研究,才能找到消除細菌耐藥性的根本方法。為控制耐藥性沙門氏菌感染的蔓延，研究畜牧業中抗菌素的使用造成食源性沙門菌耐藥性變化與臨床分離的耐藥菌株之間的關系，加大對沙門氏菌耐藥性監測力度是非常必要的。建議一種藥物不要長期應用，可采取輪換用藥的方式，避免耐藥性的產生。

[1]AlSalim,T,Saeed,MEM,Hadi,JS,Zeino,M,Gany, R,Kadioglu,O,Titinchi,SJJ,Abbo,HS,Efferth,T. Cytotoxicity of Novel Sulfanilamides Towards Sensitive and Multidrug-resistant Leukemia Cells[J]. CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY.2014,21(23): 2715-2725.

[2]馬孟根，王紅寧，余勇，等.豬源致病性沙門氏菌耐藥基因的分析[J].畜牧獸醫學報,2006,37(1),65-70.

[3]黃凱，陳素娟，黃駿，等.動物源性沙門氏菌的耐藥性分析及氟苯尼考類耐藥基因的鑒定[J].中國畜牧獸醫，2015,42(2)：459－466.

[4]趙俊利，石瑞麗，李志芳，等.內蒙古地區奶牛源致病性沙門氏菌耐藥性分析及ESBLS基因檢測[J].中國畜牧獸醫，2015,42(8):2150-2159.

[5]譚偉成，盧景.50株鴨源致病性沙門氏菌的分離鑒定及藥物敏感性檢測[J].上海畜牧獸醫通訊，2011, 2:43-45.

[6]施開創，李鳳梅，鄒聯斌，等.雞源致病性沙門氏菌的分離鑒定及血清型和藥物敏感性分析[J].中國畜牧獸醫，2015，42(8)：2160－2168.

[7]Swedberg G,Skold O.Plasmid-borne sulfonamide resistance determinants studied by Restriction enzyme analysis[J].J Baeteriol,1983,153(3): 1228-1237.

Source of salmonella in chicken sulfa drug resistance gene detection

XUE Yuan，WANG Xiao-fei，NIU Xin-xin，LIAO Chong，SUN Ying，TIAN Li-hong
(College of wildlife resource o f Northeast Forest University，Harbin 150040，China)

K-B method is used to detect 35 salmonella strains in heilongjiang province chicken the source of sulfa drug resistant genes.According to the prevalence of drug resistant genes,to guide clinical rational drug use.The results show that the source of 35 strains of chicken salmonella to sulⅠgene positive rate was 100%,sulⅡgene positive rate was 68.6%, sulⅢgene positive rate was 94.3%。

salmonella;sulfonamides;sulⅠgene;sulⅡgene;sulⅢgene

Q343.1

B

1673-1085（2016）03-0010-03

編輯部版權頁聲明：

《家禽科學》雜志社

2016-02-21

國家自然科學基金（31502119）；黑龍江省博士后科研啟動金（LBH-Q14002）。

薛原（1978～），女，漢族，黑龍江饒河人，講師，博士，主要從事細菌耐藥性方面的研究。

**通訊作者，E-mail:xueyuan-1978@163.com。

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