產氫菌的分離鑒定及發酵性能

張存勝，王文娟，王振斌，邵淑萍,，馬海樂（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江0；固體廢物處理與環境安全教育部重實驗室（清華大學），北京 00084；青島啤酒股份有限公司，山東 青島6600）

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產氫菌的分離鑒定及發酵性能

張存勝1,2，王文娟1，王振斌1，邵淑萍1,3，馬海樂1
（1江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江212013；2固體廢物處理與環境安全教育部重實驗室（清華大學），北京 100084；3青島啤酒股份有限公司，山東 青島266100）

摘要：為了獲得高性能的產氫菌，從堿處理后活性污泥中分離純化得到兩株產氫菌（H-1和H-2），生物學鑒定表明兩株菌均為Enterobacter種屬，H-1菌為Enterobacter cancerogeous HG6 2A種屬，而H-2與Enterobacter homaechei 83的關系最親近。發酵實驗結果表明，將H-1和H-2菌液進行1∶1混合時發酵性能最佳，對應的發酵時間和產氫量分別為33h和861mL/L，混合發酵克服了H-1菌單獨發酵氫產量低和H-2菌發酵時間長的缺陷。發酵液中主要揮發性脂肪酸（VFA）為乙酸和丁酸，表明兩株菌的發酵類型均為丁酸型發酵。由于兩株菌的協同作用，混合發酵初期VFA的累積速率降低，提高了發酵體系的穩定性。

關鍵詞：產氫菌；16S rDNA；制氫；發酵；協同作用

第一作者及聯系人：張存勝（1983—），男，講師，研究方向為生物質能源、食品廢棄物資源化利用。E-mail zhangcs@mail.ujs.edu.cn。

生物暗發酵處理生物質廢棄物制氫已逐漸成為生物質能源領域的研究熱點之一，傳統活性污泥發酵過程中耗氫菌較多，生物質氫轉化率較低，非產氫菌產生的有毒物質往往抑制產氫菌活性。純菌發酵避免了非產氫菌對產氫菌的底物競爭和次級代謝產物的抑制，能夠提高生物質的氫轉化率。目前的產氫菌主要有包括梭菌（Clostridium）[1]、腸桿菌（Enterobacter）[2]、芽孢桿菌（Bacillus）[3]、埃希氏菌（Escherichia）[4]等幾大類，但目前的產氫菌發酵仍存在發酵時間長，產氫效率低等問題，高昂的成本仍然限制產氫菌發酵的工業化應用[5]。為了獲得高性能的產氫菌，本文進行了活性污泥產氫菌篩分研究，通過克隆和16S rRNA測序等手段實現產氫菌種屬鑒定，并對分離出的產氫菌進行了發酵性能研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

菌種來源：產氫菌是利用堿法處理活性污泥馴化后得到的。初始厭氧污泥取自江蘇大學鏡湖，經2mm篩過濾去除枝葉等雜質，于40L厭氧發酵罐中馴化3個月備用。利用6mol/L的NaOH溶液將備用污泥調節pH值至12.0±0.1并保持24h[6]。

1.1.2培養基

液體培養基（g/L）：葡萄糖 20；胰蛋白胨 4；牛肉膏 2；酵母汁 1；L-半胱氨酸 0.5；NaCl 3；MgCl20.1；FeSO4·7H2O 0.1；K2HPO41.5；維生素液10mL；微量元素液 10mL。

維生素液（g/L）：抗壞血酸 0.025；檸檬酸 0.02；對氨基苯甲酸 0.01。

微量元素液（g/L）：MnSO4·7H2O 0.01；ZnSO4·7H2O 0.05；H3PO40.01；CaCl20.01；CoCl2·6H2O 0.2。

固體培養基：液體培養基+瓊脂（1.6 ％～2.0％）。pH值為6.0。

1.2實驗方法

1.2.1產氫菌富集培養

取100 g堿處理后的活性污泥于三角瓶中，加入滅菌玻璃珠手動旋轉至污泥顆粒搗碎。在超凈工作臺上，取10mL菌懸液接種于盛有150mL產氫培養基的250mL發酵瓶中，連接產氫密封及氣體收集裝置后，將發酵瓶置于37℃恒溫水浴鍋中培養，24h后測量所產氣體的成分，若有氫氣生成，說明產氫菌得到富集。

1.2.2產氫菌的分離篩選

初篩：取lmL富集好的種子液用無菌生理鹽水依次制成10?1～10?5稀釋梯度的菌懸液，分別取不同梯度下的菌懸液1mL進行培養（雙重疊皿培養法），于生化培養箱中37℃培養12h，挑取產氣泡的單個菌落于平板劃線培養（平板劃線法），觀察菌體形態、大小是否一致，重復上述操作直到得到純化的菌株。

復篩：將分離到的產氫菌株接種于盛有150mL產氫培養基的發酵瓶中，上封5mL液體石蠟，以橡膠塞密封，用氮氣掃除發酵瓶中的空氣，置于37℃的恒溫水浴鍋中培養。通過排水法收集產生的氣體，采用氣相色譜法檢測其是否含有H2，判斷此菌株是否為產氫菌株。選取產氣能力強的菌株進行保藏鑒定。

1.2.3產氫菌種保藏

本實驗主要采用液體石蠟保藏法[7]，該法是將菌種置于液體培養基中，浸入石蠟進行厭氧封存，于4℃的冰箱中保藏。

1.2.4暗發酵實驗

采用間歇實驗測定菌株的產氣曲線：將富集培養12h的產氫菌按10％的接種量接種于盛有200mL液體培養基的發酵瓶中，上封5mL液體石蠟，以橡膠塞密封，以流速為200mL/min的氮氣掃除發酵瓶中的空氣5min，在37℃恒溫水浴條件下培養，記錄每小時的產氣量并檢測氫氣濃度，繪制產氫曲線。

產氫菌按照H-1與H-2為1∶0、0∶1、3∶1、1∶1和1∶3的比例混合，分別考察單菌和混菌發酵產氫性能。

1.3分析方法

1.3.1產氫菌的形態鑒定

通過對菌株的菌落形態、個體形態和革蘭氏反應對細菌形態和性質進行初步鑒定[7]。

1.3.2DNA的提取與檢測

（1）總DNA提取

將菌種于液體培養基富集培養兩次，直接作為樣品進行DNA提取。

（2）16S rDNA的PCR擴增

① 擴增引物：采用擴增細菌16S rRNA的通用引物，序列如下。

Forward 27 F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3。

Reverse 1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3’。

② PCR擴增體系如表1所示。

③ 擴增條件：預變性95℃，5min；變性95℃，1min；退火55℃，1min；延伸72℃，90 s；重復上述3個步驟35個循環，然后延伸72℃，10min；最后10℃冷卻。

表1　PCR擴增體系

（3）電泳

擴增結束后，取2.5 μL PCR產物加入1 μL 10*Loading buffer混合均勻，通過1％瓊脂糖凝膠進行電泳，利用溴酚藍作指示劑，檢測PCR擴增產物。最后用EB作染色劑涂布染色30min，在BIO-RAD凝膠成像系統中成像。

（4）序列測定

擴增產物引物合成及測序委托南京金斯瑞公司完成。

1.3.3氣體檢測和VFA分析

用SP-6890氣相色譜儀進行生物氣體成分測定，配置TCD檢測器和TDX-01不銹鋼柱（2m×3mm，配碳分子篩）。進樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為140℃、160℃和160℃，載氣為Ar，柱前壓為0.08mPa。

揮發性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）由氣相色譜儀（GC-5890，HP）檢測，配有氫火焰檢測器（FID）和毛細管柱（安捷倫1909/N-133HPINNOWAX，30m×0.250mm），進樣口和檢測器溫度分別為240℃和260℃。柱箱采用如下程序升溫：初溫100℃，保持1min；以15 ℃/min的速率升溫至220℃，保持5min。載氣為氮氣，氮氣、氫氣和空氣的流速分別為290mL/min、170mL/min和290mL/min。

2　結果與討論

2.1產氫菌的形態特征

經過初篩和復篩，最終選定兩株產氣能力較強的菌株，分別命名為H-1和H-2。對分離出的兩株菌進行生物學和掃描電鏡觀察，結果見圖1和表2，由結果可知，H-1菌為短桿狀革蘭氏陰性菌，H-2菌為長桿狀革蘭氏陽性菌，兩株產氫菌在固體培養基菌落形態均為乳白色、光滑、半透明，菌落表面微微突起。在厭氧環境下單胞生長，好氧環境下集結生長，屬于兼性厭氧菌。兩株菌在電子顯微鏡下都可觀察到運動狀態，在掃描電鏡下均未觀察到兩株菌有芽孢出現。

圖1　菌株H-1和H-2的掃描電鏡圖

表2　細菌的生物學特征

2.2基于16S rRNA 的系統發育分析

將篩選出的兩株菌進行16S rRNA基因序列測定分析，所得序列與GenBank數據庫中已知16S rDNA序列進行比較，通過NCBI的Blast序列比對進行同源性分析。結果表明新分離的兩株菌的16S rDNA基因與Enterobacter屬各種的同源性大于99％，但兩株菌種之間不具有相關性。為了進一步確定該產氫菌在生命進化中的分類學地位，對兩株菌進行了系統發育學分析，圖2表明它們是Enterobacter屬的成員，H-1種屬為Enterobacter cancerogeous HG6 2A，同源性達到100％；H-2與Enterobacter homaechei 83的關系最親近，其相似性達到99％。查閱大量文獻發現，這兩種菌株產氫特性尚未有報道。

圖2　基于16S rDNA序列的菌株的系統發育樹

2.3氫氣產量

圖3顯示了H-1和H-2菌的單獨與混合發酵過程氫氣積累量的變化。由圖3可知，第1、2組（即H-1和H-2單獨發酵）的起始階段，H-1菌產氫速率較H-2菌快，發酵至25h時氫氣產量不再增加，之后維持在119mL的水平不再變化；與H-1菌不同，H-2菌暗發酵初始階段有顯著的發酵遲滯期，發酵至60h后氫產量才有顯著的提高，發酵至第100h時氫氣量不再增加，說明發酵過程結束，發酵結束后的氫氣量為187mL，與H-1菌相比，H-2菌的氫產量高68mL，占H-1菌總產氫量的57.1％，這說明H-2菌產氫能力比H-1菌高。

圖3　H-1和H-2菌的產氫積累曲線

圖3同時顯示了H-1和H-2菌混合發酵的氫產量的變化，結果表明，第3、4、5組（H-1與H-2混合發酵）的產氫速率和氫產量均高于第1組（H-1菌單獨發酵），第3、4、5組的氫產量分別為172mL、167mL和129mL，對應的發酵時間為67h、33h和28h。盡管第3組（H-1與H-2比例為3∶1）的氫產量比第4組（H-1與H-2比例為1∶1）時高5mL，但其發酵時間比后者高一倍多。因此，從發酵時間和氫產量判斷，H-1菌液與H-2菌液比例為1∶1時的發酵性能最佳，在1∶1條件下，混菌發酵的氫產量比單獨H-1菌發酵提高了48mL，發酵時間略有延長，比單獨H-2菌發酵降低了20mL，但發酵時間縮短了67h，這說明H-1和H-2以1∶1混合發酵時性能優于每株菌單獨發酵性能。

表3顯示了不同比例下產氫菌發酵實驗結果，在菌比例為1∶1（第4組）時，氫氣和VFA濃度分別為61.6％和4.0 g/L，均為5組中最高，盡管VFA濃度相對較高，但第4組最終pH值卻高于其他組，這說明第4組發酵液的緩沖能力高于其他組，進一步說明H-1與H-2以1∶1的比例混合時，發酵性能最佳。

表3　兩株產氫菌單獨與混合發酵實驗結果

由表4可知，H-1和H-2菌的氫產量分別為595mL/L和935mL/L，H-2菌產氫能力明顯高于文獻值。為了縮短發酵時間，將H-1與H-2菌按1∶1比例混合后，混合菌的產氫能力為861mL/L，比H-1菌單獨發酵的產氫能力提高了44.7％，這說明混合菌發酵克服了單菌發酵的缺陷，提高了產氫性能。

表4　篩選出的產氫菌產氫能力與文獻值對比

2.4發酵液中VFA和乙醇濃度

兩株菌發酵過程中VFA的變化如圖4所示。除第2組（H-2單獨發酵）外，其他組別的VFA在發酵的初始階段均迅速升高，發酵至20h后，VFA積累量均在3.0 g/L以上，隨后發酵液中VFA增加量明顯減少，其中，第4組的VFA在發酵結束后VFA濃度達到4.0 g/L。而第2組的VFA呈現先迅速增加至1.8 g/L后緩慢降低，第60h后又迅速增加，最后維持在3.6 g/L左右，這說明H-2產氫菌對有機質的降解速率比較慢。

圖4　兩株菌發酵過程中VFA的變化

圖5　發酵液中VFA和乙醇含量

發酵結束后發酵液中的VFA主要為乙酸和丁酸，如圖5所示，同時含有少量的丙酸、乳酸、異戊酸和戊酸，值得注意的是，在每組的發酵液中均有一定量的乙醇存在，雖然所產氣體主要成分為H2和CO2，但乙醇和乙酸的含量并不符合乙醇型發酵的要求[10]。因此，該兩株菌的發酵類型為丁酸型發酵。

結合圖3和圖4可知，較快的VFA生成可以促進氫氣的快速生成，發酵時間相對較短（第1、3、4、5組），而較慢VFA生成速率會導致較低的產氫速率（第2組）。H-2產氫菌單獨發酵時，VFA生成速率較低，限制了氫氣的生成，這說明產酸階段是H-2菌產氫過程的限速步驟。而H-1菌單獨發酵時，產氫曲線無較長的停滯期，說明H-1菌的產酸速率高于產氫速率。將兩株菌混合發酵時，產氫速率得到了一定程度的提高，可能是由于發酵初始階段H-1菌產生的過量VFA同時被H-2菌轉化成氫氣的原因；同時H-2菌對VFA的利用，減緩了體系VFA的積累速度，維持了系統的穩定性。因此，混合菌發酵性能提高是兩株菌協同作用的結果。

3　結論

通過生物形態學觀察和分子生物學鑒定，從堿處理后活性污泥分離出的兩株產氫菌均為桿狀細菌，種屬為Enterobacter，其中，H-1種屬為Enterobacter cancerogeous HG6 2A，H-2與Enterobacter homaechei 83的關系最親近。單獨產氫發酵時，H-1和H-2菌的發酵時間和氫產量分別為25 h、100 h和595mL/L、935mL/L，H-1菌產氫速率明顯高于H-2，但H-2菌的氫產量比H-1菌高57.1％。混合發酵實驗表明，將H-1和H-2菌混合發酵能夠克服單菌發酵時的缺陷，顯著提高了產氫速率和縮短發酵時間，兩株菌的協同作用是混菌發酵性能提高的原因。

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綜述與專論

Screening，identification of hydrogenogen and the research of its fermentation performance

ZHANG Cunsheng1,2，WANG Wenjuan1，WANG Zhenbin1，SHAO Shuping1,3，MA Haile1，
（1School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2Key Laboratory for Solid Waste Management and Environment Safety（Tsinghua University），Ministry of Eduction of China，Beijing 100084，China；3Tsingtao Brewery Co., Ltd., Qingdao 266100，Shandong，China）

Abstract：In order to obtain high performance hydrogen-producing bacteria，two strains (H-1 and H-2) were screened from activated sludge which was pretreated by alkali. Biological identification showed that the two strains were of Enterobacter species. H-1 was Enterobacter cancerogeous HG6 2A species and H-2 had the closest relationship with Enterobacter homaechei 83. Results showed that the best performance could be achieved from co-fermentation at the ratio of 1∶1 (H-1∶H-2). The corresponding fermentation time and hydrogen yield were 33h and 861mL/L，respectively. The defects of lower hydrogen yield by H-1 and longer fermentation time by H-2 were overcome by co-fermentation. The main volatile fatty acids (VFA) in the broth were acetate and butyrate，indicating that the fermentation of the two strains were both butyrate type. Due to the synergistic effect of the two strains，the accumulation rate of VFA reduced at the initial of fermentation. As a result，the stability of the system was enhanced.

Key words：hydrogenogen; 16S rDNA; hydrogen production; fermentation; synergistic effect

中圖分類號：X 712；TK 91

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–1184–06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.035

收稿日期：2015- 09-06; 修改稿日期：2015-11-02。

基金項目：中國博士后科學基金（2014M561589）、江蘇省自然科學基金青年基金項目（BK20150487）、中聯環SWMES教育部重點實驗室開放基金（SWMES 2015-11）及江蘇高校優勢學科建設工程項目。