酒精發酵中殺菌劑的研究進展

張強（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

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酒精發酵中殺菌劑的研究進展

張強
（長春理工大學生命科學技術學院，吉林 長春 130022）

摘要：酒精發酵是一個非常復雜的微生物反應過程。在這個過程中，除了生產菌外，還會從原料、空氣、水等帶入相當數量的雜菌，從而降低酒精得率，影響酒精的正常生產。因此如何有效控制雜菌的感染，對整個酒精生產至關重要。本文綜述了酒精發酵中殺菌劑的研究進展，主要介紹了酒精發酵過程中染菌的原因、危害、檢測方法以及常見的污染雜菌，重點介紹了漂白粉、青霉素、克菌靈、酒花及植物提取物等殺菌劑的使用。指出減少酒精發酵中的雜菌污染，加強細菌抗藥性的研究，尋找安全天然殺菌劑替代品是未來研究的關鍵。

關鍵詞：殺菌劑；酒精；克菌靈；發酵

第一作者：張強（1969—），男，博士，副教授，主要從事生物質能源研究。E-mail corn11@126.com。

自從20世紀70年代石油危機爆發以來，燃料短缺以及日益惡化的環境問題，使燃料酒精作為可再生能源越來越受到人們的關注[1]。

酒精發酵是一個復雜的微生物反應過程，一般要求純種培養。在酒精發酵過程中，除了生產菌外，還會從原料、空氣、水等帶入一定數量的雜菌，雜菌感染是影響酒精得率的主要因素。常見雜菌包括乙酸菌、乳酸菌、枯草芽孢菌等。少量雜菌不會對發酵過程產生明顯的影響，但是雜菌如果大量繁殖，就會給酒精生產帶來嚴重危害。雜菌的擴繁可造成可發酵糖減少，其代謝產物會影響酵母菌的數量、質量以及酶的活力?？梢哉f雜菌污染輕者影響酒精產量和質量，重者導致倒罐，甚至停產。因此，如何有效控制生產中雜菌污染是酒精發酵工業的重點工作之一，對于提高酒精企業生產的穩定性以及經濟效益至關重要[2-3]。

本文主要介紹了酒精發酵過程中染菌的原因、危害、檢測方法以及常見的污染雜菌，重點對漂白粉、青霉素、克菌靈、酒花及植物提取物等殺菌劑的使用進行概述。

1　酒精發酵過程中染菌原因

一般來講，在采用玉米等糧食作物為原材料進行酒精發酵的過程中，都需要經過原料處理、添加酶制劑及營養物等過程，而在此過程中，很有可能會出現雜菌污染，主要來自以下幾個方面[4]。

1.1原輔料污染

淀粉質原料發酵生產酒精，必須經過液化糖化步驟，由于糖化酶不能耐受較高溫度，因此不能采用濕熱滅菌來處理發酵液，從而使原料帶來大量雜菌。目前酒精生產企業普遍采用中低溫蒸煮，蒸煮的溫度不能徹底殺滅自身所帶來的雜菌，也導致了耐溫雜菌的存在。另外采用淀粉質原料時，原料處理過程需添加一定數量的淀粉酶、糖化酶以及部分蛋白酶，這些輔料在出廠后、運輸、使用過程中會出現污染，鏡檢時可檢出桿菌、球菌等。發酵過程中需添加的磷酸鹽、硫酸銨、尿素等營養物質也會帶來雜菌污染。

1.2水污染

酒精生產的許多工序需要用水，例如濕法粉碎、干法粉碎以及酵母菌擴培等。這些工藝水直接參與發酵過程，如果沒有經過消毒處理，或是僅僅經過簡單處理，也會帶來大量的雜菌污染。

1.3空氣污染

自然空氣中含有灰塵顆粒、水蒸氣和各種雜菌，每立方米約有五千至十萬個微生物。酒母繁殖階段，需通風培養，如果空氣沒有進行有效除菌處理，將會帶來大量的雜菌污染。

1.4設備及管道污染

設備和管道應定期滅菌，破損應及時維修，否則會帶來雜菌。另外生產設備或管路存在死角，滅菌時如果不徹底，也會導致發酵液染菌。

1.5清液回配污染

清液回配是酒精廠提高酒精糟液固定物含量，降低蒸發負荷并節約用水、節約能耗的有效手段。采用清液回配發酵，雖然回配清液溫度較高，但仍有耐溫雜菌生存，也會導致發酵過程雜菌污染。

1.6酒母污染

釀酒酵母也可能成為一個污染源。用于酒精發酵的釀酒酵母接種量約為10％。酒精企業一般先培養小酒母，后培養大酒母，即自然培養法培養酵母，這個過程也可帶來雜菌污染。

2　酒精發酵過程中染菌危害

隨著發酵工業不斷發展，發酵染菌率呈不斷下降趨勢，但仍有部分企業發酵染菌率居高不下。主要危害表現在以下幾個方面[5]。

2.1競爭營養物質，導致酒精得率降低

酒精發酵中常見的雜菌乳酸菌和酵母菌有相似的營養需求。它們將爭奪發酵醪中的營養物質，特別是碳源，使酒精得率降低。乙酸菌代謝所需碳源和能量主要來自酒精，隨著代謝產物乙酸的不斷積累，酒精會大量消耗，造成得率損失。

2.2改變生產環境，抑制酵母的生長繁殖

發酵過程中感染的乙酸菌是需氧菌，乳酸菌是厭氧菌，它們分泌乙酸、乳酸和其他副產物，導致pH值下降，揮發酸升高。由于H+濃度能改變原生質膜膠體的電荷，而原生質膜影響物質和離子通透性，所以酸度會改變酵母的存在環境，抑制酵母的生長繁殖[6]。

2.3雜菌會分泌多種有害物質，抑制或殺死酵母

細菌的代謝產物乳酸和乙酸對酵母有較強的抑制作用。發酵醪中乙酸質量分數達0.01％時，酵母的生命活動受到影響，0.2％時則全部被抑制。乳酸的抑制質量分數為1％～4％。另外乙酸和乳酸可協同抑制酵母的生長，這種協同作用所需的抑制濃度更低。丁酸的抑制濃度比乳酸和乙酸更明顯，0.005％的丁酸就會抑制酵母的增殖[7]。另外，一定濃度的乳酸和乙酸也會對淀粉酶和糖化酶的活性起到抑制作用，造成發酵殘糖升高，發酵不徹底。

3　酒精發酵雜菌判定

酒精發酵是否感染雜菌可通過兩種方法進行判定[8]。一是通過鏡檢，酵母通常為圓形或卵圓形，而細菌一般較小，呈現圓形和細長形兩種。當酒精發酵染菌時，從顯微鏡中可明顯看出所染雜菌類型及數量，由此可以推斷染菌的程度。二是通過測定發酵醪液的揮發酸，判斷染菌程度。酒精發酵通常感染的是乙酸菌和乳酸菌等，它們代謝會產生一些易揮發的有機酸，因此測定揮發酸的高低是檢驗雜菌感染的重要指標。未感染雜菌時揮發酸一般在0.012％ 以下。通常將兩種方法結合起來使用，效果會更好。

4　常見的污染雜菌

自然界有許多微生物能進行酒精發酵，但是真正得到廣泛應用的是釀酒酵母。利用釀酒酵母發酵生產酒精是目前最經濟的方法。酒精發酵屬于開放式發酵，在發酵液中還存在一定數量的其他微生物，危害酒精的生產，這些微生物稱為雜菌[9-10]。常見的雜菌主要有兩大類：細菌和野生酵母。①細菌對酒精發酵危害最大，革蘭氏陽性細菌包括乳酸菌及丁酸菌等。革蘭氏陰性細菌包括乙酸菌及大腸桿菌等。②野生酵母主要包括假絲酵母和嗜殺酵母。

4.1乳酸菌

乳酸菌是能使糖類生成乳酸的一類細菌的總稱，形狀為桿菌或球菌，它們有著復雜的營養需求。由于繁殖速率高且可以耐較低pH值環境，是每個酒精廠實際存在的最棘手的一類污染菌。NARENDRANATH等[11]指出，乳酸菌污染水平達到106CFU/mL（CFU為菌落形成單位）時，將使正常濃度的小麥醪液酒精產量減少近2％，較嚴重的污染（109CFU/mL）將有更明顯的影響，可導致酒精產量降低3.8％～7.6％ 。

乳酸菌的糖類代謝途徑是嚴格的厭氧發酵，按發酵類型可分為3類：專性同型發酵、兼性異型發酵和專性異型發酵[12]，代表菌株見表1。在專性同型發酵中，乳酸是己糖代謝的主要終產物，幾乎全部通過糖酵解途徑將一分子己糖發酵成兩分子乳酸，這種類型的乳酸菌含有果糖二磷酸醛縮酶，但沒有磷酸戊糖異構酶，所以不能發酵戊糖和葡萄酸鹽。專性異型發酵的乳酸菌能夠利用磷酸甘油醛或磷酸戊糖異構酶途徑發酵糖產生幾種終產物的混合物，這些終產物包括乳酸、乙酸、酒精和二氧化碳及少量的甲酸和丁二酸，見圖1。乳酸菌對發酵的主要影響是產生和分泌對酵母有抑制作用的化合物，隨著有機酸的不斷積累，將嚴重地威脅酵母的生存。

表1　乳酸菌發酵類型及代表菌株

圖1　乳酸菌己糖發酵的主要途徑

4.2乙酸菌

乙酸菌是一種好氧菌，能將發酵液中的糖類等營養物質吸收利用，產生大量的乙酸，是酒精生產中害處最大的一種細菌[13]。如果發酵過程中發生乙酸菌污染，乙酸菌可將已生成的酒精氧化成乙醛、乙酸，進而氧化為水和二氧化碳。當發酵液中乙酸質量分數達0.01％時，酵母菌的生命活動即受影響；當乙酸質量分數達0.2％時，酵母菌就完全受到抑制。該菌可耐10％～11％的酒精。

酵母菌擴培罐和醪液罐最容易受乙酸菌污染。在擴培罐中，通風和強攪拌雖然可促進酵母生長和增殖，但也為乙酸菌的繁殖提供了適宜的生存環境，在擴培系統染菌逐步加重。實際上擴培罐中并不是真正的有氧環境，特別是在使用發酵醪時，其中溶解氧含量低，不過乙酸菌可以在罐頂部生長，該處流動濺起的醪液能為乙酸菌創造一個適宜的生存環境[14]。另外，在厭氧條件下，酵母產生的酒精也是乙酸菌的優良營養物。乙酸菌可以通過呼吸作用直接氧化糖和酒精生成能量，在含有酒精的發酵罐中更容易出現乙酸菌污染的問題。如果醪液和發酵罐頂部有充足的氧氣，這些細菌將大量繁殖并把酒精轉化為乙酸和其他產品。乙酸菌糖代謝途徑有多種，磷酸己糖旁路（HMP）和三羧酸循環（TCA）是其中占優勢的代謝途徑，代謝主產物是乙酸，所需能量來自酒精、甘油和乳酸鹽，主要取決于可利用的碳源。

4.3丁酸菌

丁酸菌屬芽胞菌，多數為嫌氣性，具有固定游離氮的能力，生長溫度30～40℃。丁酸菌對酸抵抗性弱，pH值小于4.9時，就不再生長繁殖。發酵過程中一旦感染該菌，危害相當大，因為丁酸菌能將糖份轉化為丁酸，丁酸具有較強的抑制酵母菌繁殖能力。當醪液中丁酸質量分數達0.005％時，酵母的增殖即受到抑制，其抑制酵母的能力是乙酸的20倍。因此，丁酸菌不僅造成酒精發酵過程糖分損失，還會嚴重抑制酵母的增殖和代謝，迫使發酵過程停止。

5　酒精發酵常用的殺菌劑

選擇合適的殺菌劑是控制雜菌最有效方法和最關鍵的環節。目前生產中采用的殺菌劑有漂白粉、青霉素、克菌靈、酒花及植物提取物等。

5.1漂白粉

漂白粉作為消毒劑已經廣泛應用在自來水中。它由氯氣和熱石灰反應所得，消毒作用是因為次氯酸鈣在水中產生次氯酸的結果。次氯酸和次氯酸根能夠穿過細菌的細胞壁進入細菌內部，在氯離子的氧化作用下，細菌內的某些酶系統受到破壞，導致細菌死亡。

陳世忠等[15]在酒母醪中添加漂白粉進行殺菌，酒母醪中揮發酸都在0.09mg/mL 以下。發酵醪中添加漂白粉殺菌，前期揮發酸從0.13～0.15mg/mL 降到0.11mg/mL 以下，雜菌從5～6個桿菌、4個球菌降至3～4個桿菌、2個球菌。發酵期的酒分、酵母數都很正常。

史淑芝等[16]采用不同殺菌劑對能源甜菜酒精發酵進行了研究，發現漂白粉時雖然使酒精發酵過程中pH值下降幅度較小，但它的酒精轉化率較低，可能由于漂白粉對酵母具有一定的傷害作用，致使最終酒精得率降低。

漂白粉常用于發酵設備，例如發酵罐及管道的消毒。漂白粉使用時一般先配成質量分數為1％～2％的溶液，然后再加到糖化醪或發酵醪中。漂白粉有效氯含量一般為25％～35％。加量為0.5～2.0 mg/mL，這是國家的標準用量，使用中不得超標。

5.2青霉素

酒精工業生產一般通過添加抗生素以控制雜菌污染。據報道，使用青霉素己有150年以上的歷史。青霉素由于分子中含有4 個原子構成的β-內酰胺結構（圖2），故統稱為β-內酰胺抗生素。青霉素是利用青霉菌進行培養，從其培養液中獲得的一種有機酸，一般用其鉀鹽或鈉鹽，主要用于抑制革蘭氏陽性細菌的感染。

圖2　青霉素結構

革蘭氏陽性細菌細胞壁主要由黏肽構成。黏肽的前體物質通過相互交連形成網狀結構，而這種交連作用需要在轉肽酶的作用下才能完成。由于青霉素與黏肽的前體物質互相競爭轉肽酶，導致黏肽合成受阻，細胞壁缺損，失去保護作用，從而導致細菌死亡。因此，青霉素對酒精發酵有害的細菌，例如乳酸菌、乙酸菌、丁酸菌等有明顯的抑制作用，但這種抑制作用主要發生在細菌的繁殖旺盛期，而對靜止狀態下的細菌則作用較弱。釀酒酵母細胞壁主要由葡聚糖和苷露聚糖構成，因而青霉素對酵母沒有影響。青霉素是目前酒精生產企業廣泛應用的一種殺菌劑[17]。

利用抗生素抑制乳桿菌等雜菌，青霉素比氯四環素、桿菌膚、氯霉素和土霉素更有效，其用量介于0.75～2U/mL。HYNES等[18]認為在間歇發酵中青霉素的濃度一般要超過1.5mg/L才能抑制乳酸菌，因為青霉素不是一種耐酸的抗生素，在pH值為5以下會部分失活。

李繼德[19]按0.6～1.2U/mL（醪液）的量把青霉素加入到發酵醪及酒母醪中，控酸效果非常明顯，起到了較好的抑菌效果。環境條件好時少用，環境條件差時多用；冬季時少用，夏季時多用；原料經過高溫蒸煮時少用，低溫蒸煮時多用。另外青霉素的加入量應適當，過少不能達到滅菌效果，過多則會造成浪費。

范懷德[20]采用青霉素替代硫酸后，使用量為0.5～1 U/mL，可以有效地抑制雜菌污染，提高酒母質量，防止硫酸對人體的危害。此時酵母細胞的各項指標均符合工藝要求。酒母醪發酵正常，酸度降低，特別在夏季使用、效果更為明顯。

范靜等[21]在薯干酒精生產中添加青霉素，使用后可使酸度下降0.2，殘糖下降0.15％ ，外觀糖度下降0.5 "BX，淀粉出酒率提高約2.7％。

然而人們發現，青霉素在酒精發酵使用過程中的濫用已引發多抗性菌株的出現。細菌耐藥性系指細菌對于抗菌藥物作用的耐受性，耐藥性一旦產生，藥物的療效作用就明顯下降。當長期應用抗生素時，占多數的敏感菌株不斷被殺滅，耐藥菌株就大量繁殖，替代敏感菌株，使細菌對該種藥物的耐藥率不斷升高，這已經引起了人們的關注。

孫振江等[22]研究了青霉素、安菌泰、莫能菌素3種殺菌劑在木薯酒精發酵中的殺菌效果。指出3種殺菌劑均能有效進行殺菌，最好在發酵初期添加，但殺菌劑添加量不能超過10mg/L，否則會對酵母產生抑制作用。發酵過程中將3種殺菌劑交替使用，從而避免使用一種殺菌劑產生抗藥性的問題。

李力群等[23]在15L 發酵罐中進行玉米濃醪酒精發酵。采用鏈霉素1.4U/mL，土霉素0.7U/mL，青霉素0.9U/mL 組成的優化復合抗生素，抑菌效果明顯，最終酒精度達到了17.2％ ，揮發酸0.20mg/L。3種抗生素的聯合使用，增強了抑菌的效果，避免了抗藥性的問題。

青霉素是酒精生產中最常用的殺菌劑，另外還有鏈霉素和抗乳菌素。雖然鏈霉素和抗乳菌素也有較好的殺菌作用，但成本較高，一般酒精企業都不采用。

5.3克菌靈

克菌靈具有廣譜高效的殺菌效果，是酒精生產中專用殺菌劑。它主要通過抑制細菌細胞壁合成和干擾蛋白質合成而達到抑菌作用，因此能夠有效抑制或殺滅酒精生產過程中的乳酸菌、乙酸菌等常見雜菌，而對生產菌株沒有任何的毒副作用。

于成等[24]在玉米酒精生產中發現，在前發酵期添加克菌靈較為合適，加人量為6mg/L時，抑制雜菌的效果較明顯。發酵速度加快，雜菌減少，發酵酒度高。發酵周期可維持在55～60h。

張家偉等[25]研究發現，克菌靈對酒精發酵過程中常見的乳酸菌、乙酸菌等雜菌具有較好的抑制殺滅作用，殺菌率在85％以上。克菌靈無論是低濃度還是高濃度，對釀酒酵母沒有任何毒副作用，其形態、出芽率、發酵活力均不受影響，而且能夠促進酵母生長，增強發酵活力。

本文作者[26]曾經在玉米酒精生產中添加克菌靈進行實驗，發現克菌靈可有效抑制雜菌生長。在發酵前期加入，最佳使用量為6mg/L，酸度可降低0.2，酒精度可提高0.4％（體積比），原料出酒率提高0.9％。另據蔣敬全[4]報道，一個以糖蜜為原料年產5 萬噸酒精廠，以克菌靈完全替代濃硫酸抑制雜菌，可直接增加經濟效益296萬元。而以淀粉質為原料年產5萬噸酒精廠，可增加經濟效益214萬元。

克菌靈在酒精生產中殺菌效果顯著，且不會出現耐藥性。另外可以改變傳統以濃硫酸抑制雜菌的生產工藝，減少發酵過程中濃硫酸的用量及對發酵設備的腐蝕作用。目前克菌靈已在國內多家酒精企業應用，國外的巴西、泰國、越南也有使用克菌靈產品。

5.4酒花及植物提取物

藥用植物具有顯著的生理活性，廣泛應用于抗菌等領域。隨著綠色消費的興起，藥用植物的開發和利用越來越引起人們的關注。同時，由于抗生素的濫用，在眾多方面已引起許多問題，如多抗性菌株的出現等，因此已產生了使用安全天然代替品的迫切要求[27]。

酒花，即啤酒花，是來源于歐洲和西亞的野生植物，它生長迅速，在很多氣候溫和的地區如中國、英國、澳大利亞和法國等都有生長。人們很早就認識到β-酒花酸能夠增強抑菌效果。1993年，SIMPSON[28]研究了乳酸菌對酒花酸的敏感性，指出酒花酸起移動離子載體的作用，可以消除跨膜pH值梯度，抑制乳酸菌的生長。另外質子從胞外越過細胞膜進入細胞內，導致細胞內外pH值差異，使細胞對糖的吸收受到抑制，乳酸或乙酸等代謝物不能夠分泌。

2002年BetaTec與Hohenheim大學合作，采用全水相工藝從酒花的CO2萃取物中得到了兩種可用于酒精工業的酒花天然抗菌劑Iso StabTM和Lacto StabTM。它們含有酒花酸，對酒精發酵過程中的雜菌具有良好的抗性。通過在一個1.9億升玉米燃料酒精生產企業實踐證明，在抑制濃度下，抗菌劑Iso StabTM被連續加入到600m3種子罐，前10h添加Iso StabTM，后14h不添加。采取這種方法試驗進行了14天。4天后發現乳酸和乙酸的濃度明顯降低，8天后乳酸和乙酸幾乎消失[29]。這兩種抗菌劑已經被美國和加拿大的酒精生產企業所采用，目前可在國際市場上購買到。

鄭進保[30]對大量藥用植物提取物在酒精發酵中的抑菌作用進行了系統研究，發現烏梅、麻黃、地榆、黃連、石榴皮、山茱英等提取物均能不同程度地抑制乳酸菌的生長。0.05g/mL的烏梅提取物可促進釀酒酵母的生長，卻抑制乳酸菌的生長。0.01g/mL黃連提取物能夠強烈抑制乳酸菌的生長，而對釀酒酵母基本不起抑制作用；發酵過程中添加0.05g/mL的烏梅提取物可使乳酸菌由6×107CFU/mL降低到1.0×104CFU/mL，而酒精產量可提高1.45mg/mL。

鑒于藥用植物獨特的抗菌活性，作為安全天然代替品已經引起了人們極大的關注[31]。

6　結語

解決酒精發酵工業中的染菌問題，應當“防重于治”，只有嚴防才能消除或減少雜菌的污染。防止染菌應嚴格工藝管理、防止空氣帶菌、培養基應徹底滅菌、合理消除管路、死角帶菌等，另外要抓好菌種、原料和水的處理以及環境衛生，從根本上切斷污染源。如果能有效防治雜菌感染，不僅能提高酒精得率，節省大量的人力物力，而且能避免由于染菌而造成的經濟損失。

防菌固然重要，但抑菌才是關鍵，如同一個問題的兩個方面。目前抗生素是酒精企業廣泛使用的殺菌劑。為了保持抗生素的有效性，應重視其合理使用。盡管理論上認為抗生素在蒸餾等處理后會分解而不殘留在酒糟中，但大量證據顯示，工業抗生素的濫用會污染地表水和地下水。巴西在酒精生產中使用抗生素控制細菌，現已從該甘蔗農業生態系統中分離出多抗性細菌。2005年底，歐盟內用于作為動物飼料的復合物，其發酵產物已經不允許有抗生素殘留。隨著在農業和技術領域應用抗生素而使病原菌產生多抗性的關注日益增長，應加強細菌抗藥性的研究，尋找安全天然的殺菌劑替代品，在此基礎上，防抑結合，標本兼治，才能促進酒精工業健康發展。

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Research progress on fungicides during ethanol fermentation

ZHANG Qiang
（School of Life Science and Technology，Changchun University of Science and Technology，Changchun 130022，Jilin，China ）

Abstract：Ethanol fermentation is a complex microbial process. During the process，a significant number of bacteria will be brought in from raw materials，air，water，etc.，which will reduce yield of ethanol and affect production of ethanol. Therefore，how to effectively control the bacteria infection is essential for the ethanol production. Research progress on fungicides during ethanol fermentation was reviewed in this paper. The source，contamination，testing methods of the common harmful bacteria during ethanol fermentation were introduced focusing on the application of bleaching powder，penicillin，“kejunling” and hops and plant extracts. Reducing the bacteria infection during ethanol fermentation，strengthening the study of bacteria resistance and finding safe and natural alternatives to fungicides are the keys to future research.

Key words：fungicide；ethanol；kejunling；fermentation

中圖分類號：TK 6

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–1167–06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.032

收稿日期：2015-08-31；修改稿日期：2015-10-25。

基金項目：吉林省教育廳科研項目（吉教科合字[2014]第34號）。