生物過程工程研究在創(chuàng)新生物醫(yī)藥開發(fā)中應用的驅(qū)動力
——生物反應器

孫楊，聶簡琪，劉秀霞，楊艷坤，戴曉峰，白仲虎（糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

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生物過程工程研究在創(chuàng)新生物醫(yī)藥開發(fā)中應用的驅(qū)動力
——生物反應器

孫楊，聶簡琪，劉秀霞，楊艷坤，戴曉峰，白仲虎
（糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

摘要：近年創(chuàng)新生物醫(yī)藥在生物產(chǎn)業(yè)中的比重逐漸增大，也給生物產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟效益，靶點篩選及分子構建等上游技術的進步是促進生物醫(yī)藥進步的主要原因。隨著目前細胞培養(yǎng)技術在生物醫(yī)藥生產(chǎn)中的廣泛應用，對細胞培養(yǎng)技術的要求也不斷提高，同時細胞培養(yǎng)技術的實現(xiàn)載體——生物反應器的技術改進和創(chuàng)新也越發(fā)凸顯其重要性。本文介紹了生物反應器在創(chuàng)新生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應用種類、發(fā)展趨勢及發(fā)展驅(qū)動力，回顧了全球范圍內(nèi)新型生物反應器的發(fā)展成果，包括新型反應器技術及過程分析技術在生物醫(yī)藥中的應用，最后，分析了中國生物反應器的發(fā)展現(xiàn)狀與問題，指出了生物反應器的發(fā)展與進步應以提高生物培養(yǎng)過程的穩(wěn)定性最終提高產(chǎn)品的質(zhì)量而不是以提高產(chǎn)量為主要目標。本文詳細闡述現(xiàn)代生物反應器技術及基于“質(zhì)量源于設計”的質(zhì)量控制理念在其中所起到的關鍵作用，以及生物反應器的技術發(fā)展的現(xiàn)狀和未來走向。

關鍵詞：生物反應器；生物過程工程；質(zhì)量源于設計；過程分析技術；創(chuàng)新生物醫(yī)藥；生物工程；微反應器

第一作者：孫楊（1988—），男，博士研究生，研究方向主要為生物過程工程研究及高通量技術應用。聯(lián)系人：白仲虎，教授，博士生導師，研究領域包括QbD導向的生物過程工程優(yōu)化策略及高通量生物反應器的研發(fā)、治療性抗體片段藥物的開發(fā)、臨床免疫分析技術產(chǎn)品的研發(fā)等。E-mail baizhonghu@jiangnan.edu.cn。

近20年來全球工業(yè)生物技術產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，尤其是生物醫(yī)藥和大宗化學品的生物制造技術產(chǎn)業(yè)。全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，據(jù)美國相關機構2013年統(tǒng)計全球生物醫(yī)藥產(chǎn)值約1997億美元[1-2]，在2010—2020年間將保持年均速13.5％左右，到2020年接近5000億美元的產(chǎn)值[3]。而基于“細胞培養(yǎng)”技術的蛋白質(zhì)醫(yī)藥已成為生物醫(yī)藥的重要組成部分[4]，中國生物醫(yī)藥市場未來5～10年的發(fā)展主流也將會與世界生物技術藥物發(fā)展方向一樣，重點發(fā)展重組蛋白藥物，尤其是基于哺乳細胞培養(yǎng)生產(chǎn)人源化和全人源治療性抗體產(chǎn)業(yè)的顯著進步[5-6]，目前輝瑞、葛蘭素史克、強生等國際創(chuàng)新生物醫(yī)藥研發(fā)機構在細胞培養(yǎng)過程工程研究中確實取得了巨大的進步和發(fā)展。這些發(fā)展也同樣推動了生物醫(yī)藥開發(fā)中過程工程研究從方法學到技術手段的飛速進步。生物醫(yī)藥過程工程開發(fā)、研究策略和方法的發(fā)展體現(xiàn)在硬件技術平臺和理念兩個方面。硬件方面指的是實施規(guī)模化生物反應的核心裝置生物反應器，理念指的是ICH Q8、Q10和Q11中所提倡的“設計決定質(zhì)量”（quality by design，QbD），并在產(chǎn)品質(zhì)量和穩(wěn)定性為主要目標下達到生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程研發(fā)和產(chǎn)品質(zhì)量控制的目的[7-10]。本文從生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀、市場規(guī)模、未來發(fā)展趨勢入手，闡述現(xiàn)代生物反應器技術及基于QbD的質(zhì)量控制理念在其中所起到的關鍵作用，以及生物反應器的技術發(fā)展的現(xiàn)狀和未來走向。

1　生物反應器在創(chuàng)新生物醫(yī)藥開發(fā)應用中的種類、發(fā)展驅(qū)動力與發(fā)展趨勢

1.1生物反應器的類型與應用

目前生物醫(yī)藥開發(fā)技術的基礎研究和工業(yè)化技術在過去十幾年里突飛猛進，鑒于生物反應體系的多樣性和目標的復雜性，生物反應器發(fā)展出諸多的種類。截至目前，應用于創(chuàng)新醫(yī)藥開發(fā)的生物反應器的相關基礎技術研究、產(chǎn)品設計創(chuàng)新、制造技術革新是一個全球范圍內(nèi)的關注熱點。表1根據(jù)主要生物反應器的生物技術應用領域?qū)ι锓磻鞯姆诸愖龀龊喴偨Y。

1.2全球范圍內(nèi)生物反應器發(fā)展的驅(qū)動力

全球生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)和新型治療技術手段日新月異的發(fā)展對規(guī)模化哺乳細胞培養(yǎng)技術提出了更高的要求。包括生產(chǎn)效率的提高、產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定、生產(chǎn)過程成本的控制。例如在人源化治療性抗體的發(fā)展，全球治療性抗體市場在2011年已達到446億美元，并保持5.3％的年增速，預計在2016年將達到600億美元市場總值。

各種細胞培養(yǎng)技術在現(xiàn)代生物醫(yī)藥技術中占據(jù)了絕對控制的地位。從1995—2011年間，歐盟醫(yī)藥管理局（EMA）所批準的所有生物醫(yī)藥中，78.3％需要用細胞培養(yǎng)技術來生產(chǎn)，而生物反應器是實現(xiàn)各類細胞培養(yǎng)的基石。CHO細胞、大腸桿菌、酵母細胞占到了歐盟EMA所批準的生物藥生產(chǎn)用細胞系的83.4％以上。各種細胞培養(yǎng)技術對生物反應器有著不一樣的技術要求和培養(yǎng)規(guī)模需要[12]。

全球生物過程工程的研發(fā)理念進步巨大。目前國際上生物醫(yī)藥研發(fā)巨頭如輝瑞、GSK、強生等醫(yī)藥生產(chǎn)研發(fā)公司等在推動創(chuàng)新生物醫(yī)藥發(fā)展過程中，也推動了動物細胞培養(yǎng)過程工程的研究理念和方法的進步。這些進步是從技術手段、方法、研究理念和目標等方面與傳統(tǒng)工業(yè)生物技術的開發(fā)有所區(qū)別。其中主要的理論來源是人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調(diào)會議ICH（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use）公布的標準 Q8、Q10和Q11中提倡的“質(zhì)量源于設計”的概念，其主要是指在具體實施生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程研發(fā)及質(zhì)量控制的過程中，要以產(chǎn)品的穩(wěn)定性和質(zhì)量為最高的目標，其具體的實施過程是前期通過實驗設計（design of experiment，DoE）、多變元參數(shù)分析（multivariate analysis，MVA）和過程分析技術（process analytical technology，PAT）以及對細胞動態(tài)代謝生理學的研究基礎上對細胞培養(yǎng)生長的整個過程有一個深入的了解，通過以上技術手段確定產(chǎn)品生產(chǎn)過程中與質(zhì)量相關的關鍵過程參數(shù)（critical process attributes，CPAs），收集多次細胞培養(yǎng)過程的過程參數(shù)，建立培養(yǎng)過程批式模型，最終建立細胞培養(yǎng)過程關鍵過程參數(shù)和保證產(chǎn)品質(zhì)量的過程設計空間，以獲得在產(chǎn)品生產(chǎn)過程細胞培養(yǎng)控制的可執(zhí)行方案，最終實現(xiàn)在生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程中，對產(chǎn)品質(zhì)量的控制不只是對最終產(chǎn)品的質(zhì)量檢測控制，主要是實現(xiàn)培養(yǎng)過程的空間設計及過程監(jiān)控。但是在實施多變元批式模型的建立過程中，考慮到生物醫(yī)藥過程研究高成本的因素，希望建立一個合適合理的過程縮小（scale down）策略，通過實驗室規(guī)模的細胞培養(yǎng)建立過程空間模型來指導生產(chǎn)規(guī)模控制。而這些過程縮小策略也必須依賴于生物反應器的技術進步，最新的生物反應器技術手段發(fā)展包括：細胞株篩選與評價中采用高通量培養(yǎng)技術，基于微型生物反應器的平行培養(yǎng)技術，以及基于微流控的微型生物反應器技術。生物過程工程研究理念的革新，可以大大提高生物過程工程研究的效率。目前在蛋白質(zhì)醫(yī)藥研究的過程開發(fā)中，可以達到在數(shù)月內(nèi)，快速實現(xiàn)“從DNA到成熟工藝”的整個開發(fā)過程。

1.3生物反應器的技術發(fā)展趨勢與市場

1.3.1一次性生物反應器

在實現(xiàn)細胞培養(yǎng)工藝要求的條件下，為提高生產(chǎn)過程的靈活性、降低過程污染、減少規(guī)定設備的巨大資金投入、有效控制產(chǎn)品開發(fā)的風險，近10年來，一次性生物反應器（disposable bioreactor）是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中生物反應器的最為突出的發(fā)展方向[13-15]。用于懸浮細胞培養(yǎng)的攪拌式（STR）一次性生物反應器的工作體積已經(jīng)可以達到2000L的規(guī)模；波浪式（wave bag）一次性生物反應器的體積也可以達到1000L的規(guī)模；用于貼壁細胞培養(yǎng)的固定床式的一次性生物反應器體積也已達到500L的規(guī)模。圖1總結了目前國外的幾種主要一次性生物反應器和其工作體積。

近年來由于免疫細胞治療技術在臨床應用方面取得了突破性的進展，比如DC-CIK細胞治療和嵌合抗原受體T細胞技術（CAR-T）[16-17]針對病人個體的T細胞擴增培養(yǎng)，也進一步擴展了一次性生物反應器的應用范圍。事實上體積相對較小的一次性生物反應器對細胞免疫治療這個新興治療技術的廣泛臨床應用將起到巨大的技術支撐作用。

圖1　國外幾種主要供應商生產(chǎn)的細胞培養(yǎng)用一次性生物反應器

全球一次性生物反應器的市場規(guī)模在2014年就達到了2.02億美元，并將保持18.4％的增長，預計在2019年達到4.7億美元。目前一次性生物反應器的市場主要集中在北美和西歐，預計在未來的5年內(nèi)，新興國家的一次性生物反應器市場會快速增長[18]。國際上的主要一次性生物反應器供應商為：Thermo Fischer Scientific，Inc.（美國），Sartorius AG（德國），Merck KGaA（德國），GE Healthcare（美國）以及Pall Corporation（美國）。我國在此技術領域尚屬剛剛起步階段，尚無規(guī)模化生產(chǎn)能力。

1.3.2高通量微型生物反應器

表2　傳統(tǒng)生物過程工程研究中的技術手段及實驗流程與現(xiàn)代生物過程工程研究需要的矛盾對比

微型生物反應器的技術進步是生物反應器產(chǎn)業(yè)的另一個顯著特點。研究生物反應器的微型化、平行化以及自動化，以適應與生物過程工程研究的高通量需求，是近10年來生物過程工學科內(nèi)相關科學儀器研究的一個熱點[19-21]。其驅(qū)動力來自傳統(tǒng)意義上的過程研究技術手段已無法滿足現(xiàn)代生物過程工程的技術需求。傳統(tǒng)的生物過程工程研究流程與技術手段與現(xiàn)代生物過程研究需要的矛盾總結于表2。由表中可以發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)方法采用的是“串行”流程，效率和針對細胞克隆研究的通量均較低，無法滿足現(xiàn)在生物過程工程研究的需要。針對表2中指出的這些矛盾，目前國外在高通量平行細胞培養(yǎng)儀器研究主要集中在兩個核心點：①為提高培養(yǎng)的通量，盡量減小反應器體積，即采用不同形式的微型（毫升甚至微升級）生物反應器[22]；②為對細胞培養(yǎng)過程有深刻的理解，在高通量培養(yǎng)過程中，盡量實現(xiàn)多個不同形式的高通量平行細胞培養(yǎng)系統(tǒng)被報道，或者已經(jīng)成功商業(yè)化。但是，限于目前工業(yè)技術和相關基礎科學發(fā)展的現(xiàn)狀，鮮見能夠完美地同時解決上述兩個問題的系統(tǒng)。也有一些系統(tǒng)為了同時考慮到解決這兩個方面的需要，降低儀器系統(tǒng)的普適性，僅針對一類細胞的培養(yǎng)，比如美國的SIMCELLTM（Bioprocessors，Woburn，MA 01801，USA）微流體反應器系統(tǒng)僅適用于哺乳細胞，英國的Ambr（TPA Biosystems，UK）微反應器細胞培養(yǎng)系統(tǒng)也僅針對哺乳細胞培養(yǎng)。

2　全球范圍內(nèi)新型生物反應器發(fā)展成果

2.1用于生物過程開發(fā)的微型生物反應器和一次性生物反應器

高通量的微型生物反應器在生物過程工程開發(fā)中起著越來越重要的作用[23]。近10年來，已商業(yè)化生產(chǎn)的該類生物反應器種類繁多，比如10mL級的微型生物反應ambrTM15和ambrTM250系統(tǒng)（Sartorius）、100mL級的德國Dasgip平行細胞培養(yǎng)系統(tǒng)、Applikon的Mini-bioreactor、瑞士Inforis公司的平行細胞培養(yǎng)系統(tǒng)等。這種形式的生物反應器具有高度的過程操作靈活性，可以完全模擬大型規(guī)模化反應器內(nèi)的細胞生長環(huán)境，可以平行開展多個培養(yǎng)條件下的過程，可以實施批式、流加批式、連續(xù)培養(yǎng)等多種培養(yǎng)方式。該形式的反應器可用于疫苗生產(chǎn)的懸浮細胞培養(yǎng)和微載體細胞培養(yǎng)過程，也可以應用于CHO細胞培養(yǎng)的治療性抗體生產(chǎn)和各種微生物細胞的培養(yǎng)。以病毒疫苗生產(chǎn)為例，在MDCK細胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒疫苗[24]，VERO細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)HSV I和Polio I病毒疫苗[25]的生產(chǎn)過程，VERO細胞微載體懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)流感病毒疫苗[26]，HEK293懸浮細胞培養(yǎng)生產(chǎn)狂犬病毒疫苗[27]等。

2.1.1纖維載體的固定床反應器（ATMI LifeSciences 的iCELLis?）

ATMI LifeSciences的iCELLis?是第一個完全一體化，一次性使用的高細胞密度生物反應器[28]。它是由醫(yī)用級的聚脂微纖維（polyester microfibers）作為微載體，微載體壓縮后固定于固定床上，纖維狀載體比表面積非常高，相對于傳統(tǒng)的STR反應器來說，達到相同數(shù)目的細胞的基礎上，可以使細胞培養(yǎng)體積降低20倍以上（表3）。反應器設計操作極為簡單方便，大大降低了傳統(tǒng)STR反應器用于微載體細胞培養(yǎng)過程中的一些耗時操作，比如設備滅菌、微載體的處理等[29-31]。在使用iCELLis用于細胞培養(yǎng)可以省去逐級培養(yǎng)放大過程，可以在較低的細胞濃度下接種，比如，使用6個傳統(tǒng)滾動瓶培養(yǎng)（1750cm2）就足夠用于接種iCELLis 1000生物反應器（55L）。在培養(yǎng)過程中磁力攪拌驅(qū)動培養(yǎng)基在固定床中均勻分布，這種攪拌形式可以有效地減小細胞受到剪切力的機械損傷，從而可以增大培養(yǎng)過程活細胞比例。iCELLis的氧傳遞模式是一種獨特的“瀑布”式傳氧策略，這種形式是使培養(yǎng)基由反應器底部運動到反應器頂部，再由頂部以薄膜的形式從外壁滑落，使固定床上的載體能不斷的充分與新鮮的培養(yǎng)基接觸，實現(xiàn)氧的傳遞，保證了反應器內(nèi)的傳氧系數(shù)kLa保持較高水平。并且iCELLis采用了一次性固定床反應系統(tǒng)，下游純化階段無需離心分離細胞，iCELLis反應器系統(tǒng)的固定床結構如圖2所示。

表3　iCELLis固定床細胞培養(yǎng)反應器驗證研究結果

2.1.2一次性細胞培養(yǎng)生物反應器

一次性生物反應器以其獨特的優(yōu)勢在以細胞培養(yǎng)為基礎的生物醫(yī)藥研發(fā)生產(chǎn)中逐漸的得到推廣與應用，例如一次性波浪式細胞培養(yǎng)袋是由Wave Bioreactor公司在十幾年前（現(xiàn)在屬于GE Healthcare）引入的一種獨特的一次性細胞培養(yǎng)反應器[32-33]。在實現(xiàn)大規(guī)模的懸浮細胞培養(yǎng)時可以實施平行的多數(shù)量的該種形式的反應器（multiple bag-type bioreactors），類似的產(chǎn)品也有好多種，例如：荷蘭Applikon公司的AppliFlex、CELLution Biotech的CELL-tainer，德國Sartorious的BIOSTAT CultiBag、MetBio、PadReactor公司的Optima and OrbiCell培養(yǎng)袋等。

這種形式的一次性細胞培養(yǎng)反應器已被用于臨床細胞免疫治療[34-35]中的T細胞培養(yǎng)，這種反應器由于體積小、全封閉、一次性使用，特別適合臨床上對多個病人的個體細胞進行獨立培養(yǎng)擴增，它將對細胞免疫治療，包括CAR-T這種新興的個體化醫(yī)療手段的普及，起到巨大的支撐作用。

由一次性細胞培養(yǎng)袋開始，目前一次性生物反應器的規(guī)模可以達到噸級，形式也拓展到STR的形式[36]。比如GE的Xcellerex[37]一次性STR生物反應器XDR-50～2000。它是單容器模塊化的、可放大的一次使用生物反應器，具有標準攪拌式反應器的表現(xiàn)，可以滿足從工藝開發(fā)到生產(chǎn)的全過程需要。

圖2　iCELLis細胞培養(yǎng)反應器系統(tǒng)的固定床結構圖

一次性的生物反應器已成為了動物細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展趨勢之一，尤其是生物技術本身的發(fā)展，顯著提高了細胞系的表達量，比如CHO細胞培養(yǎng)生產(chǎn)治療性抗體的表達水平已經(jīng)可以達到10 g/L的水準，所以生產(chǎn)上對于培養(yǎng)體積的要求顯著減少，因而一次性生物反應器的培養(yǎng)規(guī)模已經(jīng)可以用于規(guī)模化生產(chǎn)。圖3總結了一次性細胞培養(yǎng)反應器的發(fā)展歷程。這種生物反應器在個性化治療的免疫細胞培養(yǎng)過程中有很好的應用前景[38]。

根據(jù)Genetic Engineering & Biotechnology News（GEN）在2015年7月做的調(diào)查報告顯示一次性生物過程工程裝置（包括上、下游）在2013— 2018期間的年增長率將保持38％。50％被調(diào)查的公司表示使用量最大的和增長最快的一次性生物過程裝置為配液系統(tǒng)，其次是哺乳細胞培養(yǎng)生物反應器，排在第三位的是生物反應器的輔助設備——一次性在線過程參數(shù)檢測傳感器，令人驚訝的是有20％的被調(diào)查公司認為一次性微生物生物反應器將保持快速增長。

圖3　一次性細胞培養(yǎng)生物反應器的發(fā)展歷程

2.1.3微流體培養(yǎng)系統(tǒng)

微流體培養(yǎng)系統(tǒng)（microfluidic culture system）：微流體技術目前在生物行業(yè)的到了廣泛的應用，如基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、基于流式細胞儀的單液滴細胞分選等，而在用于細胞培養(yǎng)的微流體裝置被稱為微型生物反應器[39]，比如Smart Biosystems公司生產(chǎn)的IVFLAB-6微流體細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，CellASCIS公司開發(fā)的ONIX微流體灌注細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，美國Bioprocessors公司的SimCellTM微型生物反應器系統(tǒng)和Hurel公司的HurelFlow微流控生物反應器等。這些基于微流控的微型生物反應器系統(tǒng)主要用于開展細胞培養(yǎng)過程的優(yōu)化研究和細胞克隆的高通量篩選，可以顯著提高細胞克隆篩選過程的效率與生產(chǎn)過程優(yōu)化效率。

例如SimCell高通量細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)是由4個獨立模塊組成：①反應器的溫控和混合攪拌是由5個培養(yǎng)箱模塊控制；②傳感器模塊通過非接觸式pH、溶氧（DO）電極提供溶氧和pH參數(shù)的測量；③取樣模塊功能為從指定反應器內(nèi)取樣并轉移到標準多孔板，用于離線參數(shù)的分析；④加液模塊實現(xiàn)同時向每個反應器內(nèi)滴加8種液體溶液。實現(xiàn)補料、流加培養(yǎng)基、pH控制時的酸堿補加等功能；⑤第五個模塊是自動化機器人系統(tǒng)，實現(xiàn)以上4個模塊的整合及自動化操作。SIMCELL的微反應器工作體積為300～800μL，可開展平行培養(yǎng)的最大細胞克隆通量可達1260個/批次。圖4是該系統(tǒng)微型生物反應器、系統(tǒng)操作模塊的簡要示意圖。高通量微型生物反應器開展細胞水平培養(yǎng)的過程工程研究，是生物醫(yī)藥過程工程研究技術的發(fā)展方向之一。

圖4　SimCell系統(tǒng)（美國Bioprocessors公司）工作原理圖、及生物反應器結構和模塊集成

圖5　常州英德高通量培養(yǎng)系統(tǒng)

2.1.4高通量細胞培養(yǎng)系統(tǒng)

我國在此領域尚屬起步階段，目前國內(nèi)高通量微型生物反應器主要處于研發(fā)推廣階段，主要有常州英德生物科技有限公司推出的高通量細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，如圖5，包括高通量細胞培養(yǎng)搖床及與之結合實現(xiàn)自動化移液、接種、取樣等功能的高通量移液工作站。該系統(tǒng)可實現(xiàn)基于“三明治板蓋”培養(yǎng)方式的高通量平行細胞培養(yǎng)，并可在移液工作站的配合下實現(xiàn)快速的取樣以便用于檢測，從而實現(xiàn)對細胞庫的快速評價，最高通量可實現(xiàn)同時對4608個克隆進行篩選，但此系統(tǒng)無法進行在線參數(shù)監(jiān)控與控制。

2.2生物過程分析技術的進步

2.2.1過程分析技術的概念

生物反應器廣泛采用過程分析技術（process analytical technology，PAT）[40-41]以提高人們對反應器內(nèi)復雜生物反應過程的及時、準確、深入的理解，進而達到控制生物過程質(zhì)量的目的，是近年來全球范圍內(nèi)生物反應器技術的一個顯著進步。

過程分析技術在化學藥物和生物醫(yī)藥生產(chǎn)過程中廣泛采用的主要推動者是美國FDA和歐盟EMA。他們對PAT的定義是：一種通過及時測量影響關鍵質(zhì)量參數(shù)（critical quality attributes，CQA）的關鍵過程參數(shù)（critical process attributes，CPAs）的一系列技術，來實現(xiàn)對制藥過程的分析、設計和控制。PAT的概念實際上定位于關鍵過程參數(shù)的及時監(jiān)測（在線、在位和離線），在生物反應過程中的最大價值是實現(xiàn)對生物反應過程本身的質(zhì)量控制，而不是傳統(tǒng)意義上的僅對最終產(chǎn)品的質(zhì)量進行控而不是傳統(tǒng)意義上的僅對最終產(chǎn)品的質(zhì)量進行控制，以達到所謂設計決定質(zhì)量的效果。所以可以這樣認為：PAT不單單是系列技術手段，它是一種以QbD為核心的技術理念[42- 43]。

2.2.2過程分析技術與裝置

較為傳統(tǒng)的檢測技術和新近發(fā)展起來的在線、在位、離線檢測技術總結于表4。這些檢測技術的聯(lián)合使用，通過及時理解細胞的生長、代謝、生產(chǎn)的生理學狀態(tài)參數(shù)和反應器內(nèi)物化環(huán)境參數(shù)，可以對給定的生物過程有一個較為全面的理解。

目前最顯著的發(fā)展趨勢是使用光譜分析技術，通過在反應器內(nèi)在反應器內(nèi)安置傳感器，通過光纖傳輸光譜信號，實現(xiàn)對反應器內(nèi)細胞的生長、代謝、生產(chǎn)的生理學狀態(tài)參數(shù)的實時在線分析，應用最廣泛的是拉曼光譜和近遠紅外光譜（NIR）。這兩個PAT技術手段是以QbD為導向的生物過程研究與實際操作的重要支撐。

表4　傳統(tǒng)的檢測技術和新近發(fā)展起來的在線、離線檢測技術總結

國際上主要的拉曼光譜在線檢測裝置供應商是Kaiser Optical Systems公司，產(chǎn)品為RamanRxn3?。NIR的一個主要供應商是Sartorius Stedim North America，該公司的主要NIR在線檢測系統(tǒng)是BioPAT?Spectro。BioPAT Spectro每15s間隔，在950～1750nm波長范圍內(nèi)對生物反應器內(nèi)培養(yǎng)液做一次掃描，再通過預先建立的數(shù)學模型對營養(yǎng)物、代謝產(chǎn)物、產(chǎn)品、細胞活性等過程參數(shù)實施實時監(jiān)測。NIR光譜和拉曼光譜數(shù)據(jù)會產(chǎn)生巨大的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)結合其他檢測技術所獲得的在線、位、離線參數(shù)，作為輸入變量組，輸入MVA軟（SIMCA，件瑞典Umetrics公司）[44]，通過研發(fā)階段的多次數(shù)據(jù)收集，建立過程批式模型和過程操作空間。在實際生產(chǎn)過程中，操作者可以通過實時PAT檢測，通過MVA數(shù)據(jù)分析，對過程狀態(tài)進行實時綜合判斷，并可以及時分析出導致過程偏差的原因。這種PAT技術加上多變元分析手段，可以使我們在實際生產(chǎn)中進行真正意義上的生物過程質(zhì)量檢測、分析與控制。MVA技術是PAT技術應用的數(shù)據(jù)處理基礎。這種關系詳見圖6。

圖6　PAT技術與MVA數(shù)據(jù)處理手段在過程質(zhì)量控制中的應用

3　我國生物反應器產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與問題

中國作為生物發(fā)酵產(chǎn)品大國，生物醫(yī)藥的需求大國，以及潛在的生物醫(yī)藥創(chuàng)新與生產(chǎn)大國，生物反應器產(chǎn)業(yè)具有極大發(fā)展?jié)摿Α５遣豢煞裾J的事實是在我國生物技術產(chǎn)業(yè)化平臺中，細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術等中下游技術是我國最薄弱的技術環(huán)節(jié)，我國生物醫(yī)藥等領域產(chǎn)業(yè)化與先進國家的差距較大，滯后的一個重要原因就是缺乏配套工藝的工業(yè)化放大技術和相應的以生物反應器為核心裝備的技術支撐系統(tǒng)。我國目前主要生產(chǎn)一些中低檔生物反應器，并且這些反應器主要針對于工業(yè)生產(chǎn)中的微生物培養(yǎng)。而在生物醫(yī)藥生產(chǎn)用的高端哺乳細胞培養(yǎng)生物反應器研發(fā)與制造方面，跟蹤國際上生物反應器的技術進步所做的努力非常有限。這主要由兩方面原因：一方面是國家政策導向，尤其是新藥審批政策的導向問題；另一方面是生物醫(yī)藥產(chǎn)品的高附加值使得生產(chǎn)企業(yè)可以承受較高的設備成本，導致生產(chǎn)企業(yè)不愿冒險嘗試國產(chǎn)生物反應器裝置，對于反應器生產(chǎn)企業(yè)而言市場驅(qū)動力不大。可以說，目前我國生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中用于哺乳細胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)治療性抗體和人用疫苗的生物反應器幾乎完全依賴進口，主要供應商集中在國際上幾個著名公司，包括Sartorius、GE、Simens、Eppendorf、Applikon，只是最近在哺乳細胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)畜用疫苗領域有了一些突破，即在2015年，成都英德生物醫(yī)藥裝備技術有限公司為我國的口蹄疫疫苗生產(chǎn)線（蘭州中農(nóng)威特），完全自主生產(chǎn)、設計、安裝了單罐批培養(yǎng)體積達到6000 L的VERO細胞懸浮培養(yǎng)生物反應器和配套裝置。并且目前我國對于生物醫(yī)藥過程工程的研究理念與發(fā)達國家也有一些差距，我國目前還停留在以提高產(chǎn)量為目的的基礎上，但對于生物醫(yī)藥產(chǎn)品，生產(chǎn)過程的穩(wěn)定性、最終產(chǎn)品的質(zhì)量比產(chǎn)量更重要，而質(zhì)量的控制在工藝開發(fā)階段就要得到重視，我國就需要在此集中力量，努力改變此領域的現(xiàn)狀。

4　結語

生物反應器技術的發(fā)展與進步必定會促進生物醫(yī)藥開發(fā)的進步，而創(chuàng)新生物醫(yī)藥的發(fā)展，在促進國民經(jīng)濟發(fā)展，完善疾病治療手段及方案的同時，也會促進生物過程工程研究的進步，由此帶來的進步表現(xiàn)在：硬件上，PAT技術在生物反應器技術上的不斷開發(fā)及應用；軟件上，QbD理念在生物醫(yī)藥生產(chǎn)中的推廣和應用。目前，隨著一次性生物反應器，微型生物反應器等新型生物反應器的發(fā)展與啟示，在生物醫(yī)藥技術作為國家發(fā)展核心競爭力而越來越得到重視之時，如何實現(xiàn)技術創(chuàng)新、產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新、產(chǎn)品創(chuàng)新，值得大家思考和共同努力。

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綜述與專論

Pioneering application of biological process engineering in innovative bio-pharmaceutical development——bioreactors

SUN Yang，NIE Jianqi，LIU Xiuxia，YANG Yankun，DAI Xiaofeng，BAI Zhonghu
（National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Abstract：In recent years，the proportion of innovative biomedical in the biotechnology industry has been increasing gradually，which is mainly due to the improvement of upstream technology such as target screening and molecule construction and brings tremendous economic benefit. With the increasing applications of cell culture technology in biomedical industry，demand for its innovation has been increasing. And so it is with the equipment bioreactors. This review introduced the categories，development trend and driving force of bioreactors in biomedical industry. The achievements of novel bioreactors including the applications of novel bioreactor technology and process analytical technology are also summarized. Finally，we discussed the development status and problems of bioreactor industry in China and pointed out that increasing the product quality rather than production is the goal of bioreactor development. This review also expounded the key role of modern bioreactor technology and the “Quality by Design”principles of ,as well as the developmenet status and trend of bioreactor technology.

Key words：bioreactor; biological process engineering; quality by design; PAT; innovative biopharmaceutical; biological engineering; microreactor

中圖分類號：Q 815

文獻標志碼：A

文章編號：1000–6613（2016）04–0971–10

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.001

收稿日期：2015-12-16；修改稿日期：2016-01-06。

基金項目：國家高技術研究發(fā)展計劃（2015AA020802）及中央高校基本科研業(yè)務費專項資金（JUSRP51401A）項目。