痰涂片鏡檢在涂陽肺結核患者隨訪中的準確性研究

夏輝 陳麗 柳正衛 李發濱 王曉萌 趙雁林

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痰涂片鏡檢在涂陽肺結核患者隨訪中的準確性研究

夏輝 陳麗 柳正衛 李發濱 王曉萌 趙雁林

目的 以MTB分離培養的結果為參考，探討痰涂片鏡檢在涂陽肺結核隨訪患者中的療效監測及評估其準確性。方法 納入2010年1月至2011年7月黑龍江省和浙江省各2個縣(市)787例涂陽肺結核患者。收集經標準化抗結核藥物治療至2個月末的679例隨訪患者痰標本，開展MTB痰涂片鏡檢和分離培養。以MTB分離培養的結果為參考，對有培養結果的670例患者計算痰涂片鏡檢用于療效監測的敏感度和特異度，以評估痰涂片鏡檢對療效監測的準確性。結果 679例隨訪患者抗結核藥物治療2個月末，痰涂片鏡檢結果有522例(76.9%)發生陰轉，其中初治患者454例(454/578，78.5%)痰涂片鏡檢陰轉，高于復治患者[68例(68/101，67.3%)]，二者差異有統計學意義(χ2=6.09，P=0.014)。670例患者治療至2個月末分離培養結果有582例(86.9%)陰性，其中初治患者502例(502/569，88.2%)，復治患者80例(80/101，79.2%)，二者分離培養陰轉率的差異有統計學意義(χ2=6.11，P=0.013)。以分離培養結果為參考標準，治療至2個月末痰涂片鏡檢的敏感度和特異度分別為69.3%(61/88，95%CI：59.7%～78.9%)和83.7%(487/582，95%CI：80.7%～86.7%)。其中，初治患者的敏感度和特異度分別為64.2%(43/67，95%CI：52.7%～75.7%)和84.1%(422/502，95%CI：80.9%～87.3%)；復治患者分別為85.7%(18/21，95%CI：70.7%～100.0%)和81.3%(65/80，95%CI：72.8%～89.8%)；治療至2個月末痰涂片鏡檢對初治與復治患者療效監測的敏感度、特異度差異均無統計學意義(χ2=3.28，P=0.070；χ2=0.40，P=0.527)。結論 在結核病治療過程中應用痰涂片鏡檢進行療效監測的敏感度和特異度均較低，應結合分離培養技術提高其準確性。

結核，肺； 痰/顯微鏡檢查； 細菌學技術； 治療結果； 評價研究

我國目前主要依賴于痰涂片鏡檢進行肺結核的診斷與隨訪時的療效監測。以往研究顯示抗結核藥物治療前痰涂片鏡檢的敏感度較低，約為40%～80%[1-2]，但特異度較高接近100%[3-4]，因此可用于肺結核的診斷。但由于痰涂片鏡檢方法既能檢測活菌，也能夠檢測到被藥物殺死的結核分枝桿菌，即患者雖抗結核治療有效，但由于痰標本中會存在少量死菌，導致痰涂片鏡檢結果仍為陽性，因此利用痰涂片鏡檢作為抗結核治療的療效監測可能無法準確反映其真實療效，而且目前對其療效監測的準確性在國內研究也很少[5-6]。本研究在基層結核病醫療機構以結核分枝桿菌分離培養為參考標準，分別收集確診涂陽肺結核患者在按照標準化抗結核藥物治療方案[7]治療至2個月末的晨痰和夜間痰各1份進行痰涂片鏡檢，檢測其在抗結核治療中療效監測的準確性，以評價患者的治療效果[7]。

資料和方法

1.患者一般資料：納入2010年1月至2011年7月黑龍江省五常市、雙城市及浙江省常山縣、浦江縣4個縣(市)的787例痰涂片鏡檢陽性的活動性肺結核患者。收集患者年齡、性別、治療史、初診時及按照標準抗結核藥物治療至2個月末的胸部X線攝影資料。納入患者年齡10～88歲，平均年齡為(46.8±18.4)歲；男557例(70.8%)，女230例 (29.2%)；初診時患者的MTB分離培養結果有13例(1.6%)發生污染，730例(92.8%)培養陽性，44例(5.6%)培養陰性；787例患者經標準化抗結核藥物治療至2個月末，有88例患者未按要求返回進行隨訪，20例患者返回隨訪但未采集到痰標本；故共收集679例隨訪患者痰標本，開展MTB痰涂片鏡檢和分離培養，排除分離培養污染的9例患者，對有培養結果的670例患者進行痰涂片鏡檢，并進行療效監測準確性的分析。

2.實驗室檢測方法：采集初診患者就診時的3份痰標本(即時痰、夜間痰、晨痰)和隨訪患者的2份痰標本(夜間痰、晨痰)進行MTB痰涂片鏡檢[7]。前者用于肺結核診斷，后者用于監測患者對抗結核藥物治療的效果。每例患者至少選取一份痰標本進行MTB分離培養。痰涂片鏡檢采用萋-尼染色[8],MTB分離培養采用簡單法[9]。

3.統計學分析：采用Excel進行數據錄入，SPSS 17.0軟件進行數據整理和分析。構成比、陰轉率、特異度、敏感度的比較采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.納入涂陽肺結核患者的痰涂片陽性級別分布：787例納入患者的的痰涂片陽性級別見表1，其中涂片結果為“+”者最高[324例(41.2%)]。初、復治患者“++++”級別所占比率差異有統計學意義(χ2=6.27，P=0.012)，其他陽性級別差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

2.納入涂陽肺結核患者的MTB痰涂片鏡檢與分離培養的結果分析：787例患者初診時進行分離培養，13例(1.6%)發生污染，730例(92.8%)陽性，44例(5.6%)陰性。培養陰性的患者隨著痰涂片鏡檢陽性級別的升高，分離培養陰性的例數也逐漸降低，有29例(65.9%)發生在痰涂片鏡檢結果為1～8條/300視野和“+”級別，僅有2例(4.5%)發生在涂片結果為“++++”級別(表2)。

3.抗結核藥物治療至2個月末痰涂片鏡檢與MTB分離培養的結果分析：按照標準化抗結核藥物治療方案治療至2個月末，收集到679例隨訪患者的痰標本，522例(76.9%)痰涂片鏡檢發生陰轉，其中初治患者454例(454/578，78.5%)痰涂片鏡檢陰轉，復治患者68例(68/101，67.3%)陰轉(表3)。初治患者治療至2個月末痰涂片鏡檢陰轉率高于復治患者，二者差異有統計學意義(χ2=6.09，P=0.014)。

表1 納入時涂陽肺結核患者的痰涂片陽性級別在初治、復治患者中的分布

表2 774例肺結核患者痰涂片鏡檢與分離培養結果

注a：除去13例分離培養發生污染的菌株

表3 679例患者抗結核藥物治療至2個月末的痰涂片鏡檢陰轉情況

按照標準化抗結核治療方案治療至2個月末，收集679例隨訪患者的痰標本，分離培養時9例(1.3%)發生污染，其他670例患者有分離培養結果。其中582例(86.9%)分離培養陰性，初治患者有502例(502/569，88.2%)，復治患者80例(80/101，79.2%)，二者分離培養陰轉率的差異有統計學意義(χ2=6.11，P=0.013)。治療至2個月末分離培養陰轉率(86.9%)高于痰涂片鏡檢陰轉率(76.9%)，且差異具有統計學意義(χ2=22.63，P<0.001)。不同痰涂片鏡檢陽性級別與初、復治肺結核患者在抗結核藥物治療至2個月末時分離培養結果見表4。

4.抗結核藥物治療至2個月末的痰涂片鏡檢效能及準確性分析：679例隨訪患者中，除去9例分離培養發生污染的患者，對有培養結果的670例患者進行分析。以分離培養結果為參考標準，在抗結核治療中痰涂片鏡檢在監測療效時的敏感度為69.3%(61/88，95%CI：59.7%～78.9%)，特異度為83.7%(487/582，95%CI：80.7%～86.7%)。其中初治患者中，痰涂片鏡檢在監測療效時的敏感度和特異度分別為64.2%(43/67，95%CI：52.7%～75.7%)和84.1%(422/502，95%CI：80.9%～87.3%)，復治患者中痰涂片鏡檢在療效監測時的敏感度和特異度分別為85.7%(18/21，95%CI：70.7%～100.0%)和81.3%(65/80，95%CI：72.8%～89.8%)。初、復治患者痰涂片鏡檢在療效監測時的敏感度、特異度差異均無統計學意義(χ2=3.28，P=0.070；χ2=0.40，P=0.527)。詳見表5。

表4 670例患者抗結核藥物治療至2個月末的分離培養陰轉情況

注 治療2個月末分離培養發生污染者均為初治患者

表5 670例患者抗結核藥物治療至2個月末的痰涂片鏡檢效能及準確性分析

注 敏感度=痰涂片鏡檢陽性(包含1～8條/300視野，+，++，+++，++++)并分離培養陽性患者例數/分離培養陽性患者例數×100%；特異度=痰涂片鏡檢陰性并分離培養陰性患者例數/分離培養陰性患者例數×100%

討 論

規范化的抗結核藥物治療及定期療效隨訪對于肺結核的控制非常重要。痰涂片鏡檢是一種快速、簡便、價格低廉的結核病實驗室檢測技術，其能夠通過菌量多少檢測出有傳染性的患者。在我國，萋-尼染色痰涂片鏡檢方法是肺結核診斷及抗結核藥物治療療效監測的主要手段，但痰涂片鏡檢無法區分死菌和活菌，因此用于療效監測有一定的局限性。本研究參照檢測活菌的分離培養技術結果，探討了痰涂片鏡檢在療效監測時的準確性。

本研究納入不同痰涂片陽性級別的活動性肺結核患者，在抗結核藥物治療前患者分離培養的陽性率為92.8%(730/787)，污染率為1.7%(13/787)，達到分離培養質量控制關于涂陽培陽比例及污染率的要求[9]，證明研究中分離培養的質量是可信的。研究結果顯示隨著痰標本含菌量的增加，分離培養陽性率也逐漸增高，由1～8條/300視野時的81.8%提高至“++++”時的98.5%。而分離培養陰性集中于痰涂片陽性級別較低即含菌量少的患者，可能是使用4%NaOH進行培養前處理時將少量細菌滅活；也有可能是患者在本次就診前使用過對結核分枝桿菌有療效的藥物，如氨基糖苷類藥物、氟喹諾酮類藥物等，需要進一步研究患者的治療史以明確原因。

納入患者按照標準化抗結核治療方案治療至2個月末，分離培養陰轉率(85.7%)顯著高于痰涂片鏡檢陰轉率(76.9%)，差異有統計學意義(χ2=22.63，P<0.001)，提示日常采用痰涂片鏡檢作為療效監測時部分患者雖然涂片鏡檢為陽性，但檢測到的抗酸桿菌可能為藥物治療后的死菌，因此單純用痰涂片鏡檢作為治療中療效監測會影響療效判斷的準確性。且初治和復治患者間的痰涂片鏡檢陰轉率(78.5%和67.3%)和分離培養陰轉率(88.2%和79.2%)差異均有統計學意義(χ2=6.09，P=0.014；χ2=6.11，P=0.013)。與分離培養相比較，在治療至2個月末時痰涂片鏡檢的敏感度(69.3%)和特異度(83.7%)均較低，提示部分患者治療有效即培養已經陰轉，但是利用痰涂片鏡檢時結果仍可能為陽性，說明痰涂片鏡檢作為療效監測有一定局限性。本研究治療至2個月末時痰涂片鏡檢敏感度與其他研究的數據接近[1-2，10]，但是特異度遠遠低于之前報道的在抗結核藥物治療前獲得的數據[3-4]，卻高于Su等[10]研究的涂陽肺結核患者抗結核藥物治療至2個月末痰涂片鏡檢的特異度(69.9%)。抗結核治療過程中痰涂片鏡檢敏感度低可能是由于肺結核患者經過有效的抗結核藥物治療后，痰標本中的菌量會減少，從而降低痰涂片鏡檢的敏感度。同樣，經過有效的抗結核治療后，痰標本中會存在一定量的死菌和混雜的非結核分枝桿菌，而分離培養僅能檢測活的結核分枝桿菌，因而可能降低療效監測時痰涂片鏡檢的特異度；其次，分離培養也存在假陰性問題，即痰涂片中存在活菌但分離培養時未檢測到，也是造成痰涂片鏡檢與之比較特異度低的另一可能原因；另外，本研究采用的是固體培養，固體培養陽性檢出率低于液體培養陽性檢出率[11]，如使用液體培養可能會提高痰涂片鏡檢的特異度。

本研究中分離培養陰性但痰涂片鏡檢陽性者有95例，比較這95例患者治療前與治療至2個月末的胸片，顯示91例(95.8%)患者在治療至2個月末時胸片表現均有改善，僅有4例變化不明顯，提示91例患者的痰涂片鏡檢陽性可能是由于痰標本中存在大量死菌所致(即假陰性)；進一步分析這95例患者的涂片結果，筆者發現1～8條/300視野為15例(15.8%)，“+”為55例(57.9%)，“++”為22例(23.2%)，“+++”與“++++”僅有3例(3.2%)，可見，治療至2個月末痰涂片鏡檢仍為陽性的患者大部分涂片結果為低陽性級別。因此，在臨床實際應用中，若發現治療至2個月末涂片鏡檢未陰轉但陽性級別較低且胸片表現有明顯改善者，應考慮為痰標本中很可能有大量死菌，可認為治療有效。

本研究也存在一定局限性，首先納入的復治患者例數較少，因此在比較初復治患者MTB痰涂片鏡檢與分離培養的效能時準確度較差；其次未對納入患者進行治療結束后的隨訪和分析，因此未能評估療程結束后的痰涂片鏡檢在療效監測方面的準確性。希望未來擴大樣本量及進行療程結束后的相關研究，進一步評價痰涂片鏡檢在療效監測中的作用。

我國大部分實驗室，特別是基層醫療機構實驗室廣泛應用痰涂片鏡檢進行隨訪時的療效監測，但本研究結果提示，應用痰涂片鏡檢進行療效監測時存在一定局限性，患者治療至2個月末的鏡檢結果與分離培養法的一致性較低，需要引起廣大基層醫務人員的注意。雖然有很多新型的基于分子生物學的結核病實驗室檢測技術出現，但是大部分新型技術是通過檢測結核分枝桿菌核酸的方法，而通過檢測核酸的技術同樣無法區分死菌或活菌，因此，在抗結核藥物治療過程中這些新技術仍舊無法用于療效監測。由于分離培養可直接檢測到活菌，在判斷療效方面準確性更高。“十二五”結核病防治規劃實施之后，我國開展分枝桿菌分離培養的實驗室數目逐漸增多，因此，有條件的實驗室在患者抗結核藥物治療過程中應結合分離培養檢測結果來進行評價，以提高療效監測的準確性。

[1] Bruchfeld J, Aderaye G, Palme IB, et al. Sputum concentration improves diagnosis of tuberculosis in a setting with a high prevalence of HIV. Trans R Soc Trop Med Hyg, 2000,94(6):677-680.

[2] Apers L, Mutsvangwa J, Magwenzi J, et al. A comparison of direct microscopy, the concentration method and the Mycobacteria Growth Indicator Tube for the examination of sputum for acid-fast bacilli.Int J Tuberc Lung Dis，2003,7(4):376-381.

[3] Chakravorty S, Dudeja M, Hanif M, et al. Utility of universal sample processing methodology, combining smear microscopy, culture, and PCR, fordiagnosis of pulmonary tuberculosis. J Clin Microbiol，2005, 43(6):2703-2708.

[4] Fodor T. Detection of mycobacteria in sputum smears prepared by cytocentrifugation and sedimentation. Tuber Lung Dis， 1995, 76(3):273-274.

[5] 鄧闖.1171份痰標本結核分枝桿菌涂片鏡檢與培養結果分析. 慢性病學雜志, 2013,14(2):112-114.

[6] 李國紅,苗潤青,賈艷輝,等.1284份痰標本分枝桿菌涂片鏡檢與培養結果分析.中國防癆雜志,2011, 33(8):492-495.

[7] 肖東樓,趙明剛,王宇.中國結核病防治規劃實施工作指南. 北京: 中國協和醫科大學出版社, 2009.

[8] 肖東樓,王文杰,許紹發，等.中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作程序及質量保證手冊.北京:中國協和醫大學出版社,2008.

[9] 趙雁林,王黎霞,成詩明,等. 中國結核病防治規劃分枝桿菌分離培養標準化操作程序集質量保證手冊. 北京: 人民衛生出版社,2013.

[10] Su WJ, Feng JY, Chiu YC,et al. Role of 2-month sputum smears in predicting culture conversion in pulmonary tuberculosis. Eur Respir J， 2011,37(2):376-383.

[11] 宋媛媛,夏輝,趙雁林.幾種液體分支桿菌分離培養方法的多中心應用評估.醫學研究雜志,2013,42(1):30-32.

(本文編輯：孟莉 范永德)

Study on accuracy of sputum smear microscopy for assessment of treatment response among smear positive pulmonary tuberculosis patients

XIAHui*,CHENLi,LIUZheng-wei,LIFa-bin,WANGXiao-meng,ZHAOYan-lin.

*NationalTuberculosisReferenceLaboratory,NationalCenterforTuberculosisControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective By comparing with culture results ofMycobacteriumtuberculosis(MTB), to evaluate the performance of smear microscopy on assessment of response to anti-tuberculosis (TB) treatment in patients with smear-positive pulmonary TB. Methods A total of 787 smear-positive pulmonary TB patients were recruited during the period from January 2010 to July 2011 in four counties in Heilongjiang and Zhejiang provinces. The sputum specimens were collected from 679 patients who completed 2 months of standardized anti-TB treatment and then culture and smear microscopy were performed to all specimens. The sensitivity and specificity of smear microscopy for monitoring the response to anti-TB treatment were determined by comparing with the culture results of 670 patients whose culture results were obtained. Results Out of 679 patients, 522 (76.9%) cases were smear microscopy converted. The proportion of smear microscopy conversion was 78.5% (454/578) among new cases, which was significantly higher than that among previously treated cases (67.3% (68/101)) (χ2=6.09,P=0.014). Among 670 cases with culture results at the end of 2 months of treatment, 582 (85.7%) cases were culture converted. The culture conversion rate among new cases (502/569, 88.2%) was significantly higher than that (80/101, 79.2%) among previously treated cases (χ2=6.11,P=0.013). The sensitivity and specificity of smear microscopy for monitoring the response to anti-TB treatment at the end of 2 months of treatment were 69.3% (61/88， 95%CI, 59.7%-78.9%) and 83.7% (487/582， 95%CI, 80.7%-86.7%) respectively in comparison with culture. The sensitivity and specificity of smear microscopy among new cases were 64.2% (43/67, 95%CI: 52.7%-75.7%) and 84.1% (422/502, 95%CI: 80.9%-87.3%) respectively while the sensitivity and specificity among previously treated cases were 85.7% (18/21, 95%CI: 70.7%-100.0%) and 81.3% (65/80, 95%CI: 72.8%-89.8%) respectively. There were no significant difference for both sensitivity and specificity of smear microscopy on assessment of response to anti-TB treatment between new cases and previously treated cases (χ2=3.28,P=0.070;χ2=0.40,P=0.527). Conclusion Smear microscopy has lower sensitivity and specificity when it is used to assess the treatment response during the course of anti-TB treatment and the accuracy can be improved in combination with culture.

Tuberculosis, pulmonary； Sputum/microscopy; Bacteriological techniques； Treatment outcome； Evaluation study

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.009

102206 北京，中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心 國家結核病參比實驗室(夏輝、趙雁林)；黑龍江省結核病預防控制中心參比實驗室(陳麗、李發濱)；浙江省疾病預防控制中心結核病預防控制所參比實驗室(柳正衛、王曉萌)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-07-14)

基金名稱：“十二五”國家科技重大專項(2014ZX10003002)