我國結核分枝桿菌gyrA不同突變類型對氟喹諾酮類藥物耐藥水平的相關性研究

張治國 杜春英 張倩 王玉峰 逄宇 趙雁林

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·論著·

我國結核分枝桿菌gyrA不同突變類型對氟喹諾酮類藥物耐藥水平的相關性研究

張治國 杜春英 張倩 王玉峰 逄宇 趙雁林

目的 研究gyrA基因在我國耐氟喹諾酮類藥物結核分枝桿菌菌株中的突變特征，以及不同突變類型與氟喹諾酮類藥物最低抑菌濃度(MIC)的關系。 方法 2007年我國開展結核病耐藥基線調查，調查選取了70個調查點，共分離結核分枝桿菌4017株，其中145株為對氧氟沙星耐藥的結核分枝桿菌菌株，有7株菌株在傳代中發生污染或傳代失敗，本研究共納入138株對氧氟沙星耐藥的結核分枝桿菌菌株。對上述菌株的氟喹諾酮類藥物耐藥相關基因(gyrA)進行測序，分析耐藥相關基因突變的特征；用微孔板稀釋法檢測這些菌株對氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的MIC，統計不同突變類型菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥率的差別。采用SPSS 11.0統計軟件進行統計學處理，同種突變類型對不同氟喹諾酮類藥物耐藥率的比較采用Fisher確切概率法進行檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。 結果 在138株氧氟沙星耐藥菌株中，總計有90株(65.2%)檢測到氟喹諾酮類藥物耐藥相關基因gyrA發生突變，其中最常見的突變發生在第94位點(34.8%，48/138)。gyrA基因第88、89和91這3個位點的突變菌株(分別為2株、3株和5株)，除莫西沙星有2株在91位點表現為高水平耐藥，其余均表現為對3種氟喹諾酮類藥物低水平耐藥；第94位點突變類型較多，導致不同的耐藥水平，第94位點天冬氨酸突變為天冬酰胺時氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的高水平耐藥比例分別為80.0%(8/10)、30.0%(3/10)和100.0%(10/10)；此外，1株第94位點天冬氨酸突變為半胱氨酸的菌株同時表現為對3種氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥；而第94位點突變為丙氨酸時與低水平氟喹諾酮類藥物耐藥有關，其對氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星低水平耐藥率分別為91.7%(11/12)、100.0%(12/12)和58.3%(7/12)。 結論gyrA基因突變是我國人群對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株最主要的耐藥機制，不同gyrA突變類型導致對氟喹諾酮類藥物不同的耐藥水平。

分枝桿菌，結核； 氟喹諾酮類； 氧氟沙星； 基因型； 抗藥性，細菌

結核病仍然是全世界重要的公共衛生問題之一[1]。據世界衛生組織估計，全球每年約有960萬例新發患者及145萬例死于結核病的患者，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，約占全球結核病負擔的10%[2]。氟喹諾酮類藥物是二線抗結核藥物的重要組成部分，由于其在體內具有較好的早期滅菌效果，因此被推薦作為備選藥物以縮短結核病患者的化療時間[3]。氟喹諾酮類藥物在MTB中的作用位點為DNA拓撲異構酶，上述酶包括A和B兩個亞基，分別由gyrA和gyrB兩個基因編碼[4]。研究表明，氟喹諾酮類藥物耐藥的主要機制為gyrA基因突變引起[5-6]。

目前，關于MTB中gyrA突變的報道較多[5-6]，而氟喹諾酮類藥物最低抑菌濃度(MIC)與gyrA不同突變位點的關系報道較少，本研究選取全國耐藥基線調查收集的對氧氟沙星耐藥的菌株為研究對象，分析gyrA基因在我國對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株中的突變特征，以及不同突變類型與不同氟喹諾酮類藥物MIC的關系。

材料和方法

一、菌株

本實驗所選取的138株對氧氟沙星耐藥的MTB菌株由中國疾病預防控制中心國家結核病參比實驗室提供，來自于2007年全國結核病耐藥性基線調查[7]。選取的過程為：根據流行病學抽樣原則，從全國31個省、自治區、直轄市(不含中國臺灣、香港和澳門地區)，采用分層整群抽樣的方法抽取70個調查點，每個調查點納入當年新診斷的涂陽結核病患者，假定初治和復治肺結核患者對利福平的耐藥率為6%和16%計算，估算納入初治和復治患者最低樣本量為3010例和1010例；考慮到調查點數量，每個調查點納入初治患者51例，復治患者17例，共納入4760例患者。經過培養鑒定，總計分離獲得4017株MTB菌株，所有菌株進行了傳統比例法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)及對硝基苯甲酸(PNB)和噻吩-2-羧酸肼(TCH)菌種鑒定，共獲得145株對氧氟沙星耐藥的MTB菌株，但有7株菌株在傳代中發生污染或傳代失敗。因此，總計138株對氧氟沙星耐藥的菌株納入本研究。標準菌株H37Rv為國家結核病參比實驗室保藏菌株。

二、試劑來源

本試驗所用改良羅氏培養基購自于珠海貝索生物技術有限公司；藥敏試驗所用氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星均購自于美國Sigma公司，使用時按照廠家提供的純度和效價計算用量；7H9培養基藥粉和營養添加劑購自于美國碧迪醫療器械有限公司；Alamar blue顯色劑購自于美國伯樂生命醫學有限公司；2×Taq預混液購自于北京康為世紀生物科技有限公司；所有引物均由北京擎科生物技術有限公司合成。

三、藥物MIC測定

按照文獻[8]所述，選用微孔板稀釋法進行MTB的MIC檢測；選取改良羅氏培養基上生長3～4 周的新鮮菌落，使用磨菌瓶分散均勻，并稀釋菌液至1個麥氏濃度(～107CFU/ml)，再以1∶20稀釋后向微孔板加入100 μl 菌液。微孔板于37 ℃ 孵育7 d后，在實驗微孔板中加入70 μl預混的顯色液(含20 μl Alamar blue和50 μl 5.0% Tween-80)，37 ℃ 孵育24 h記錄各孔的顏色；藍色孔為無MTB生長，粉色孔為有MTB生長。能抑制MTB生長(藍色孔)的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度。氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星3種藥物的濃度均設置0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32和64 μg/ml 10個測試工作濃度。參照文獻[9]，氧氟沙星、左氧氟沙星和莫西沙星的臨界濃度分別為2 μg/ml、2 μg/ml 和0.5 μg/ml；對于氧氟沙星和左氧氟沙星，當MIC≥8 μg/ml時，定義為高濃度耐藥；對于莫西沙星，當MIC≥2 μg/ml時，定義為高濃度耐藥。

四、基因組DNA提取

根據文獻[7]所述，采用簡單水煮法提取MTB基因組DNA。從改良羅氏培養基斜面使用接種環刮取MTB菌落，將菌落轉移至帶有1 ml 生理鹽水的無菌Eppendorf離心管中，80 ℃ 30 min 滅活，12 000×g離心5 min，去上清，菌體沉淀用500 μl TE(Tris-EDTA buffer solution)緩沖液(pH=8.0)充分懸浮，100 ℃沸水浴30 min，冷卻至室溫后，12 000×g離心5 min，取上清即為基因擴增模板。

五、gyrA基因擴增和測序

擴增對氟喹諾酮耐藥的相關基因gyrA基因片段(415 bp)，擴增體系如下：2×Taq預混液25 μl，上游引物(5′-TCGACTATGCGATGAGCGTG-3′)0.2 μmol，下游引物(5′-GGTAGCACCGTCGGCTCTTG-3′)0.2 μmol，基因組DNA 5 μl，剩余體積使用雙蒸水(ddH2O)補平到總體積50 μl。基因擴增條件如下：預變性94 ℃ 5 min；循環94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 延伸10 min。基因擴增產物電泳檢測后送北京擎科生物技術有限公司測序。測序結果以標準敏感菌株H37Rv基因序列作為標準，通過美國國立衛生研究院在線序列比對軟件(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行比較。

六、統計學分析

采用SPSS 11.0統計軟件進行統計學處理，同種突變類型對不同氟喹諾酮類藥物耐藥率的比較采用Fisher確切概率檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株中gyrA基因突變特征分析

在138株對氧氟沙星耐藥的菌株中，總計有90株(65.2%)檢測到對氟喹諾酮類藥物耐藥的相關基因gyrA發生突變。其中最常見的突變發生在第94位點(34.8%，48/138)，上述突變導致第94位的天冬氨酸突變為甘氨酸(12.3%，17/138)、丙氨酸(8.7%，12/138)、天冬酰胺(7.2%，10/138)、酪氨酸(3.6%，5/138)、組氨酸(2.2%，3/138)或者半胱氨酸(0.7%，1/138)；除了第94位點突變外，第90位點氨基酸突變是第二常見的突變類型，占全部菌株的23.2%(32/138)，其突變類型均為丙氨酸突變為纈氨酸；此外，還有5株突變發生在第91位點，3株在第89位點及2株在第88位點(表1)。

二、不同突變類型菌株對氧氟沙星耐藥情況分析

如表2所示，對于不同位點的氨基酸突變，第88、89和91這3個位點的突變菌株均表現為對氧氟沙星低水平耐藥(MIC<8 μg/ml)；第90位點丙氨酸突變為纈氨酸，有75.0%(24/32)的菌株表現為對氧氟沙星低水平耐藥；第94位點突變類型較多，且呈現出對氧氟沙星不同的耐藥特征，其中第94位點天冬氨酸突變為天冬酰胺、甘氨酸及組氨酸引起高水平耐藥的比例較高，分別有8/10、13/17和2/3的突變菌株對氧氟沙星的MIC≥8 μg/ml；而當第94位點天冬氨酸突變為丙氨酸和酪氨酸時，MTB菌株通常表現為低水平耐藥，分別有11/12和3/5的突變菌株對氧氟沙星的MIC<8 μg/ml。

表1 對氟喹諾酮類藥物耐藥MTB的gyrA基因突變情況

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

三、不同突變類型菌株對左氧氟沙星耐藥情況分析

不同突變類型的MTB菌株對左氧氟沙星耐藥情況的分析如表3所示，其中與氧氟沙星類似，第88、89和91這3個位點的突變均表現為對左氧氟沙星低水平耐藥。與氧氟沙星不同，在其他多種突變類型中，第90位點丙氨酸突變為纈氨酸、第94位點天冬氨酸突變為天冬酰胺及甘氨酸對左氧氟沙星高水平耐藥的比率分別為3.1%(1/32)、30.0%(3/10)和5.9%(1/17)，除94位點天冬氨酸突變為天冬酰胺外，均顯著低于氧氟沙星的耐藥比率(均為確切概率法，P值分別為0.0265、0.0698、0.000)。此外，第94位點天冬氨酸突變為半胱氨酸表現出對左氧氟沙星高水平耐藥，其MIC為8 μg/ml。

表2 MTB不同gyrA基因突變類型與對氧氟沙星耐藥的關系(株數)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

表3 MTB不同gyrA基因突變類型與對左氧氟沙星耐藥的關系(株數)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

四、不同突變類型菌株對莫西沙星耐藥情況分析

如表4所示，帶有不同gyrA基因突變的菌株對莫西沙星耐藥水平表現出較大的差異。其中第88位點、第89位點、第90位點和第91位點基因突變通常與低水平莫西沙星耐藥相關，其低水平耐藥菌株比例分別為2/2、3/3、25/32和3/5；第94位點由天冬氨酸突變為組氨酸(3/3)、天冬酰胺(10/10)、甘氨酸(12/17)和半胱氨酸(1/1)引起高水平莫西沙星耐藥，而突變為酪氨酸和丙氨酸時，共計58.8%(10/17)的菌株表現為對莫西沙星低水平耐藥。

討 論

本研究首次基于我國對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株系統開展了基于不同突變類型與耐藥水平相關性的研究，初步獲得了一些具有指導性意義的數據。

一、gyrA基因突變是我國對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株的最主要耐藥機制

氟喹諾酮類藥物在MTB中的靶標基因為DNA拓撲異構酶A亞基(gyrA)，該基因突變大多發生在基因保守區第67～106位密碼子區，常見的有第88位點、第90位點、第91位點、第94位點突變[3]。本研究結果表明，我國65.2%的對氧氟沙星耐藥的MTB菌株是由于gyrA基因突變引起的，上述比率與之前來自北京(68%)[10]、紐約(67%)[11]的比率較接近，低于俄羅斯(83%)[12]和上海(76%)[13]，而高于我國臺灣地區(50%)[14]和突尼斯(50%)[13]，導致上述差異可能是由于gyrA基因的突變存在地區性差異，與當地主要流行的MTB菌株不同有關。近年來，陸續開發了多個基于分子生物學的檢測方法用于快速檢測MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥的情況，上述檢測方法主要基于對gyrA基因耐藥相關決定區的檢測[15]。然而，本研究結果表明上述檢測方法在我國檢測的敏感度可能不甚理想，有超過30%的氟喹諾酮類藥物耐藥患者可能未能被檢測到(共計138株，90株有突變，48株無突變，無突變率34.8%)，這可能導致患者的治療延遲。因此，迫切需要針對我國分離的對氟喹諾酮類藥物耐藥的菌株進行系統研究，以揭示上述不帶有gyrA基因突變的對氟喹諾酮類藥物耐藥菌株的耐藥機制，從而為開發適于我國的新診斷試劑盒提供重要的理論依據。

表4 MTB不同gyrA基因突變類型與對莫西沙星耐藥的關系(株數)

注 Ala：丙氨酸；Asn：天冬酰胺；Val：纈氨酸；Pro：脯氨酸；His：組氨酸；Tyr：酪氨酸；Gly：甘氨酸；Cys：半胱氨酸；Asp：天冬氨酸；Ser：絲氨酸

二、gyrA基因不同突變類型引起不同水平的對氟喹諾酮類藥物耐藥

與前述報道一致，第94位點氨基酸突變是我國最常見的突變類型[3, 10-11]，其次是第90位點氨基酸突變。有前述研究表明，第90位點和第94位點氨基酸突變通常引起高水平耐藥[12]；但是本研究結果表明，第90位點丙氨酸突變為纈氨酸時，大多數菌株對氧氟沙星的MIC低于4 μg/ml，這可能是由于丙氨酸和纈氨酸同屬于非極性氨基酸，兩者在結構、電性等方面具有很相似的特征。因此，上述氨基酸的改變沒有引起gyrA與氟喹諾酮類藥物結合能力的顯著改變，進而未能導致高水平的MIC；對于第94位點而言，當天冬氨酸突變為天冬酰胺、甘氨酸和半胱氨酸時通常引起高水平的對氧氟沙星、莫西沙星耐藥；而突變為丙氨酸和酪氨酸時，通常引起低水平的對3種氟喹諾酮類藥物耐藥，可能與氨基酸性質差別有關，天冬氨酸為酸性氨基酸，而天冬酰胺、甘氨酸和半胱氨酸均為非電離的極性氨基酸。因此，上述氨基酸存在較大的差異，導致氟喹諾酮類藥物靶標gyrA結構的顯著改變，從而影響了MIC；與之相反，丙氨酸與酪氨酸均屬于非極性氨基酸，與天冬氨酸性質相似，因此，未能顯著影響MTB對氟喹諾酮類藥物的耐藥水平。此外，第88位點、第89位點及第91位點突變均為低水平的對氟喹諾酮類藥物耐藥，雖然上述位點中第89位由天冬氨酸突變為天冬酰胺，這兩種氨基酸性質差別較大，但是未能引起高水平的對氟喹諾酮類藥物耐藥，可能與上述位點并非氟喹諾酮類藥物和gyrA結合的主要位點。

三、其他耐藥機制可能影響MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥

本研究表明，我國約有35%對氟喹諾酮類藥物耐藥的MTB菌株沒有攜帶gyrA基因突變，推測上述菌株可能由于以下原因產生耐藥性：(1)部分菌株由于攜帶gyrB突變導致耐藥；(2)藥物外排泵或者細胞壁通透性機制可能參與上述菌株對氟喹諾酮類藥物耐藥；(3)可能還有新的耐藥相關基因尚未被發現。

筆者認識到本研究的不足，由于目前僅對gyrA基因在MTB對氟喹諾酮類藥物耐藥中的作用機制相對明確，因此筆者僅通過對gyrA基因的測序來分析其不同突變類型與耐藥的相關性，未考慮其他機制在氟喹諾酮類藥物中的聯合作用。全基因組測序技術為全面理解MTB耐藥機制提供了重要工具，后續的深入研究將為全面理解靶基因突變、藥物外排泵及細胞壁通透性等機制在對氟喹諾酮類藥物耐藥中的作用提供重要依據。

有研究提示，當MTB對某種抗結核藥物產生低濃度耐藥時，可以通過提高藥物的劑量以達到治療的目的[16]。作為治療耐藥結核病的重要核心藥物，氟喹諾酮類藥物日益受到人們的重視。本研究通過對gyrA不同突變類型的分析，預測患者對氟喹諾酮類藥物的耐藥水平，將為結核病患者提供更多備選藥物，具有重要的臨床價值，能夠真正實現個體化診斷及精準醫療。

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(本文編輯：郭萌)

Analysis of the relationship between differentgyrAmutations and fluoroquinolone resistance levels inMycobacteriumtuberculosisisolates from China

ZHANGZhi-guo,DUChun-ying,ZHANGQian,WANGYu-feng,PANGYu,ZHAOYan-lin.

BeijingChangpingCenterforTuberculosisControl,Beijing102200,China

ZHAOYan-lin,Email:zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To investigate the prevalence of genetic mutations located in thegyrAgene among fluoroquinolone (FQs)-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates, and the relationship between different mutations and minimal inhibitory concentrations (MIC) against fluoroquinolones. Methods The national drug resistance baseline survey conducted in 2007 randomly enrolled 70 clusters from 31 provinces. A total of 4017M.tuberculosisstrains were collected, of which 138 were ofloxacin (Ofx)-resistant. All isolates were sequenced for genetic mutations ingyrAconferring FQ resistance. The broth dilution method was used to determine the MIC of these isolates against Ofx, levofloxacin (Lfx) and moxifloxacin (Mfx). Fisher’s exact test was performed to compare the high-level resistance rates of different FQs.P<0.05 was considered to be statistically significant. Results Of the 138 Ofx-resistantM.tuberculosisisolates, 90 (65.2%) isolates harboredgyrAmutations, the most frequent mutation being in codon 94 (34.8%，48/138). Strains with mutations in codons 88, 89 or 91 ofgyrAexhibited low-level FQ-resistance. Codon 94 mutations were diverse and were associated with different levels of FQ-resistance. When the mutation of codon 94 resulted in substitution of Asp by Asn, high-level Ofx-, Lfx- and Mfx-resistance was observed in 80.0% (8/10), 30.0% (3/10) and 100.0% (10/10) of the isolates, respectively. In addition, one strain harboring a substitution of this Asp by Cys exhibited high-level resistance to Ofx, Lfx and Mfx. In contrast, we found that strains harboring a substitution of this Asp by Ala had low-level FQ resistance; 91.7% (11/12), 100.0% (12/12) and 58.3% (7/12) of these isolates were resistant to low-levels of Ofx, Lfx and Mfx, respectively. Conclusion Mutation ofgyrAis the most important mechanism that confers FQ resistance in China. Strains with different types ofgyrAmutations are associated with different levels of FQ resistance.

Mycobacteriumtuberculosis; Fluoroquinolones; Ofloxacin; Geneotyper; Drug resistance; Bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.09.003

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX0003-003)

102200 北京市昌平區結核病防治所(張治國、杜春英、張倩)；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心(王玉峰、逄宇、趙雁林)

趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2016-07-08)