4個蘋果品種和2種砧木試管苗對熱處理脫毒效應的研究

康曉育 李幗英 趙新紅

摘要：本試驗采用變溫熱處理結合莖尖培養對4個蘋果品種和2種砧木組培苗脫除潛隱性病毒的效應進行了研究。結果表明：不同的蘋果品種和砧木耐熱性不同。其中王林、珠美海棠的耐熱性最強，L—6、金矮生的耐熱性居中，首紅、天汪1號耐熱性最差。在相同處理條件下，不同的蘋果基因型脫毒率存在差異。其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時脫除率達到100%；金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時脫除率達到100%；ASGV的脫除率也在80%以上；株美海棠、L—6、天汪1號、首紅的脫除率較低。另外，不同病毒種類脫除的難易程度也存有差異，ACLSV最容易脫除，ASGV最難脫除，ASPV居中。

關鍵詞：蘋果品種；砧木；熱處理；脫毒率

文章編號：1005-345X（2016）04-0001-04 中圖分類號：S661.1 文獻標識碼：A

蘋果是世界四大水果之一，以其豐富的營養價值和較高的經濟效益而成為世界上主要栽培的經濟果樹。病毒病害是蘋果生產上的主要病害之一，蘋果樹受病毒侵染后，病毒在細胞核內增殖，干擾、破壞樹體的正常生理機能，導致生長勢減退，產量下降，品質變劣，因此，果樹無毒化栽培已成為現代果樹產業發展的方向。

蘋果潛隱性病毒包括蘋果莖痘病毒（AS—PV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）。該類病毒雖無明顯癥狀，但可導致果樹樹勢變弱，果品品質變劣，給果樹生產帶來極大危害。目前主要通過莖尖培養、熱處理結合莖尖培養進行脫除。傳統的病毒檢測一般采用酶聯免疫法，隨著分子生物學技術的發展，目前逐漸被先進的RT—PCR方法代替。由于不同的果樹品種有其不同的結構和生理特點，因此脫毒效率各不相同。

本試驗以4個蘋果品種和2種砧木為試材，采用熱處理結合莖尖培養進行脫毒處理，比較不同基因型和砧木在脫毒過程中的反應和脫毒效率，以期為蘋果病毒的脫除方法研究提供指導，同時為蘋果品種和砧木無病毒材料的繁育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗在天水市果樹研究所植物組培室進行。供試材料為組培室現有蘋果砧木試管苗珠美海棠、L—6，蘋果品種試管苗天汪1號、王林、首紅、金矮生及各品種和砧木田間生長旺梢。試管苗的繼代培養基為MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5 mg/L。

1.2試驗方法

1.2.1單純莖尖培養 在新梢生長最快時期（5月中下旬），選擇大田生長健壯的母樹，采集生長旺盛、長約2～3 cm頂梢，去葉后作為外植體，用洗滌劑水浸3 min后，流水沖洗60～90 min；移入超凈工作臺上操作，倒入75%的乙醇浸泡30 s，蒸餾水沖洗后放人0.1%升汞（HgCl₂）中消毒10 min，無菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸干表面水分，在解剖鏡下迅速剝取0.5 mm莖尖進行分離培養。所用培養基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

1.2.2高溫熱處理結合莖尖培養方法將莖尖培養誘導形成的分化芽轉入MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的繼代培養基中培養。培養40 d左右時，剪取2～3 cm的芽轉接，每品種接10瓶，每瓶4株。先在室溫（24～26℃）條件下培養10 d，然后轉移到人工氣候箱中，白天14 h，晚上10 h，從25℃開始每天升高1℃，逐漸升溫至32℃。從32℃開始每天升1℃，繼續升溫至38℃時，控制溫度白天38℃、光照14 h，夜間32℃、10 h，處理30 d。熱處理結束后在無菌條件下對存活的組培苗切取未褐變、壞死的莖尖約0.5 mm接種于再生培養基上培養40 d。

1.2.3病毒檢測 對熱處理后的瓶苗剪取0.5 mm莖尖繼續轉接在再生培養基中，以單株系進行擴繁，苗數達150～200株時，以1個培養瓶為1個樣本，隨機抽取3～4個樣本，每個樣本10～15株，將所選材料送至中國農科院果樹研究所中國落葉果樹脫毒中心，利用反轉錄聚合酶鏈式反應（RT—PCR）檢測方法，檢測蘋果莖痘病毒（ASPV）、蘋果莖溝病毒（ASGV）、蘋果褪綠葉斑病毒（ACLSV）。對于單純莖尖培養脫毒的組培苗采用酶聯免疫分析法進行脫毒檢測。

1.2.4數據調查與結果統計 熱處理28 d后統計莖尖成活率、增殖系數，觀察記錄植株老葉與新梢的表現癥狀。熱處理后試管苗莖尖成活率統計：增殖系數=1 cm以上的新梢數量/存活株數；莖尖成活率=（轉接的成活莖尖數/轉接莖尖總數）×100%。病毒檢測結果進行脫毒率統計：脫毒率=（檢測呈陰性樣本數/檢測樣本總數）×100%。

2結果與分析

2.1單純莖尖培養脫毒效果

從田間采集6個樣品共135個莖尖進行分離培養，成活35個，成活率為25.9%。采用酶聯免疫分析法檢測結果顯示，直接莖尖培養法脫毒效果很低，檢測35個蘋果莖尖，有2個莖尖脫除了蘋果褪綠葉斑病毒，有1個莖尖脫除了蘋果莖痘病毒，莖溝病毒則未能脫除。脫除率僅為8.57%（表1）。

2.2熱處理+莖尖培養脫毒效果

2.2.1高溫熱處理對莖尖成活率及植株生長的影響 試管苗的最初培養溫度為25℃，逐步升溫至38℃，熱處理過程中組培苗長期處于高溫高濕的微環境中，莖尖特別容易受害褐變死亡，而且死亡程度也各不相同。從表2可看出，不同試材的耐熱性存在差異。王林、珠美海棠試材耐熱性最強，莖尖成活率較高，老葉小部分枯死，新梢生長良好；L—6、金矮生的耐熱性居中，植株老葉受害嚴重，但莖尖沒有受害；首紅、天汪1號耐熱性最差，莖尖成活率低，老葉基本全部枯死，較短新梢莖尖死亡，部分較長新梢生長良好。另外，4個蘋果品種和2種砧木增殖系數也存在明顯差異。珠美海棠增殖系數顯著高于其余品種或砧木，天汪1號、首紅則顯著低于其余品種或砧木，且二者之間也存在顯著性差異。

2.2.2不同品種和砧木脫毒率的比較 由表3可以看出，3種病毒脫除的難易程度不同，ACLSV最易脫除，6個待檢樣品其脫除率達到100%；ASPV居中，王林和金矮生脫除率達到100%，其他4個脫除率在80%～95%；ASGV最難脫除，只有王林達到100%的脫除率，其他4個脫除率在65.8%～80.5%。單純莖尖培養脫除病毒也表現了這種趨勢。另外，不同的蘋果基因型脫毒效果存在差別，其中王林脫毒效率最高，3種病毒的同時脫除率達到100%。金矮生ACLSV和ASPV兩種病毒的同時脫除率達到100%，ASGV的脫除率也在80%以上。株美海棠、L—6、天汪1號、首紅的脫除率較低。

3討論

在莖尖脫毒技術中，因外植體大小不同，成活率和脫毒率相互制約，從脫毒這一目標來看，要求莖尖越小越好，但是莖尖太小，自身營養就不足，越難分化，加之切分時機械損傷，所以污染率和死亡率也就越高。因此，應該綜合考慮成活率和脫毒率兩個指標來確定莖尖的大小，本試驗采用的是0.5 mm的長度。目前常用的脫毒方法有兩種：方法1單純莖尖培養和方法2熱處理結合莖尖培養。綜合來說，方法2的脫毒率顯著高于方法1，這說明單獨使用小莖尖培養很難脫除果樹潛隱性病毒，而熱處理與小莖尖結合則可以較好地解決這個問題。這與變溫熱處理結合莖尖培養獲得的苗子脫毒效果較好研究結果一致，晏娜等研究報道，采用38℃/32℃變溫熱處理適合大多數品種和砧木脫除蘋果潛隱性病毒。因此，該試驗采用38℃/32℃變溫熱處理對6種試材進行脫毒，發現在相同熱處理條件下，蘋果基因型不同，病毒脫除效率不同。這與程玉琴等的觀點一致。

該研究中，3種病毒各自的脫除率存在顯著差異。總體表現為ASGV最難脫，ACLSV最容易脫除，ASPV居中。不同病毒類型脫除率不同的原因，除與熱處理條件和寄主有關外，還可能與病毒本身的特性和結構有直接關系。由3種病毒的病原學研究發現三者在形態長度、體外鈍化溫度和體外保存時間均存在明顯差異，且表現出一定的規律性。如在體外鈍化溫度上，由高到低為ASGV>ASPV>ACLSV；那么這些特性是否與病毒脫除相關，還需要進一步研究。另外研究也表明凡是脫除了ASGV的試材，其他兩種病毒也都是脫除了的，而脫除了ACLSV和ASPV的試材，ASGV未必脫除。因此，對攜帶有ASGV的試材進行脫毒處理后，可首先通過檢測ASGV進行初選，再對ASGV檢測呈陰性的材料進行其他病毒的檢測。這樣就可以大大減少病毒檢測的成本，提高檢測效率。