瓜實蠅DNA甲基化的MSAP體系建立與優化

龔治 周世豪 馬華博 張亞楠 符悅冠

摘 要 瓜實蠅[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]是中國重要的蔬菜害蟲，但其DNA甲基化研究尚未見報道。甲基化敏感擴增多態性是研究DNA甲基化的重要技術之一。通過對酶切反應、連接、PCR擴增和引物篩選等條件優化，建立瓜實蠅MSAP反應體系，即：①20 μL酶切體系中加入10 U的限制性內切酶與600 ng基因組DNA，于37℃酶切反應過夜；②20 μL連接體系中加入T4 連接酶1 U，HpaⅡ-MspⅠ-adapter接頭50 pmol，EcoR I-adapter接頭5 pmol，并于16℃反應12 h；③連接產物稀釋后進行PCR預擴增和選擇性擴增，再經6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測結果。通過該體系篩選出適用于瓜實蠅基因組DNA甲基化多態性研究的6對引物；瓜實蠅MSAP體系為瓜實蠅的表觀遺傳學研究提供了技術支持。

關鍵詞 瓜實蠅 ；DNA甲基化 ；甲基化敏感擴增多態性 ；表觀遺傳

中圖分類號 S186 ；Q963 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.008

Abstract The melon fly [Bactrocera cucurbitae （Coquillett）] is one of the most important vegetables insect pest in China. However， the DNA methylation in melon fly has not been reported yet. Methylation sensitive amplified polymorphism （MSAP） is an important research tecnnique to analysis the DNA methylation. The MSAP can be established through the enzyme digestion reaction， ligation， PCR amplification system， and primer screening， such as 10 U restriction endonuclease is put in the 20 μL enzyme digestion system， and then react with 600 ng of genome DNA at 37℃ overnight； 1U of T4 ligase is put in the 20 μL ligation system， 50 pmol of HpaⅡ-MspⅠ-adapter and 5 pmol of EcoR I-adapter which react at 16℃ for 12 hours. Diluent ligation products were used in PCR to pre-amplification and selected amplification， the result is tested by silver staining and 6% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Six pairs of primers which suited for DNA methylation sensitive amplified polymorphism were selected out by this system. The MSAP system provides the technical support for the study of the epigenetics research of melon fly.

Keywords Bactrocera cucurbitae （Coquillett） ； DNA methylation ； Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP ； epigenetics

瓜實蠅[Bactrocera cucurbitae （Coquillett）]屬雙翅目（Diptera）實蠅科（Tephritidae），是世界性檢疫害蟲[1-2]，主要為害葫蘆科（Cucurbitaceae）和茄科（Solanaceae）植物，如甜瓜（Cucumis melo L.）、南瓜（Cucurbita moschata Duchesne.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、苦瓜（Momordica charantia Linn.）、西瓜（Citrullus lanatus Thunb.）、無花果（Ficus carica Linn.）、番石榴（Psidium guajava Linn.）等[3-4]。瓜實蠅廣泛分布于亞熱帶30多個國家和地區[2]，在中國主要分布于南方，包括江蘇、福建、四川、湖南、臺灣等地[5]，是中國南方發生實蠅中的優勢種，每年給中國南方果蔬生產造成重大經濟損失[6]。

當前，國內外學者對瓜實蠅的分布、寄主、危害程度、生物學、生態學、生理生化及綜合防治等進行了大量研究[5，7]。然而瓜實蠅DNA甲基化及其基因表達調控等研究鮮有報道。甲基化敏感擴增多態性（Methylation sensitive amplified polymorphism， MSAP）是研究DNA甲基化的重要方法之一，不僅能夠檢測基因組DNA甲基化位點的水平和模式，操作相對便捷，分析結果能夠直接與基因序列聯系起來，而且具有敏感性強、檢出位點多等特點，成為檢測基因組DNA甲基化的重要方法[8-9]。在中國，MSAP技術已應用于橡膠樹新品種選育[10]、果蠅基因組甲基化[11]、白背飛虱性別和翅型分化[12]等方面的研究。MSAP及其DNA甲基化已逐漸成為昆蟲研究領域的新熱點[13]。本研究以瓜實蠅為材料，建立和優化MSAP分析技術體系，為不同條件下瓜實蠅基因組DNA甲基化多態性位點的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實蠅

實驗中所使用的瓜實蠅為羽化后2～3 d的飼養多代的室內種群。

1.1.2 試劑

E.Z.N.A.TM Insect DNA kit購自Omega Bio-tek公司；EcoRⅠ，MspⅠ，HpaⅡ，T4 DNA Ligase均為NEB產品；剝離硅烷、親和硅烷購自北京鼎國生物工程公司；PCR相關試劑購自北京全式金生物技術有限公司；硝酸銀購自上海生工生物工程技術有限公司；尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED為BBI公司進口分裝藥品；其它試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

按照Insect DNA Kit試劑盒推薦的方法提取基因組DNA。提取的DNA經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量，并經紫外分光光度測定A260與A280值，并以此計算DNA的純度和濃度。DNA于-20℃保存待用。

1.2.2 酶切

選用HapⅡ/EcoRⅠ和MspⅠ/EcoRⅠ 2組內切酶分別對基因組DNA進行酶切。20 μL體系中，先加入15 μL ddH2O，再加入2 μL 10×NEB Buffer，濃度為300 ng/μL的模板DNA 2 μL，最后加入EcoRⅠ，HapⅡ或MspⅠ，酶的用量分別設置為：2、4、6、8、10 U。混勻后放入低溫循環水浴儀中，于37 ℃下進行雙酶切1.0 h。之后選用最佳酶用量，分別進行2.0、4.0、6.0、12.0 h等不同酶切時間，完成后用2%瓊脂糖凝膠檢測酶切產物。

1.2.3 連接

取等量接頭引物對混合，并于95℃加熱5 min，然后緩慢冷卻至室溫，在室溫下放置10 min制成接頭待用。連接體系為20 μL，將接頭等直接加入酶切液中，16℃連接12 h。接頭在加入酶切液之前先合為雙鏈（95℃ 5 min）。反應體系中加入雙酶切液8.0 μL，10 ×T4 Buffer 2 μL，T4 連接酶各1.0 μL，接頭引物Eco RⅠ-adapter、MspⅠ-adapter的反應終濃度分別設定為25、50、75 pmol/μL，混勻后放入低溫循環水浴儀中進行連接。研究中所用到的接頭、引物見表1。

1.2.4 預擴增

對連接產物分別進行10倍、20倍、30倍稀釋，然后取2.5 μL用于預擴增反應。整個PCR反應體系為25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，預擴增引物各1 μL（濃度為10 μmol/L）。預擴增引物間進行正交配對。PCR程序為：95℃變性3 min 后，按以下參數擴增35 個循環：95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，最后72℃延伸10 min，10℃保溫。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統觀察電泳結果。剩余產物保存至-20℃冰箱保存備用。

1.2.5 選擇性擴增

對預擴增產物分別進行10倍、20倍、30倍稀釋，然后取5 μL用于選擇性擴增反應。整個PCR反應體系為25 μL，其中2×Eco Taq PCR SuperMix 12.5 μL，選擇性擴增引物各3 μL（濃度為10 μmol/L）。選擇性擴增引物間進行正交配對。PCR程序為：95℃變性3 min 后；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35 個循環；72℃延伸10 min，10℃保溫。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像分析系統觀察電泳結果。剩余產物保存至-20℃冰箱保存備用。

1.2.6 引物篩選

采用優化后的AFLP體系對16對選擇性擴增引物進行篩選。擴增產物取5 μL 與3 μL loading buffer 混勻，95 ℃變性5 min，轉至冰浴中冷卻，取3 μL上樣，6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳3 h，銀染參照文獻等[14]方法。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 提取結果

瓜實蠅基因組DNA電泳圖見圖1。由圖1可以看出，提取的基因組DNA主帶清晰無降解，無RNA污染。而由表2可知，所提取的瓜實蠅基因組DNA的OD值均在1.7～1.9，說明DNA純度較高，能夠滿足MSAP試驗要求。

2.2 酶切反應體系

用不同量的HapⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2組內切酶分別對基因組DNA進行酶切，并于37℃下酶切1 h后，其產物用2%瓊脂糖凝膠進行檢測。由圖2不同酶量的產物電泳圖可看出，10 U組的酶切效果最好，而其它各組仍然依稀可見基因組DNA。而酶切時間的篩選結果（圖3）可以看出，不同酶切時間均能對基因組DNA進行一定程度的消化，但12 h 處理中，4、4泳道內呈彌散狀且帶形整齊，表明酶切完全，其酶切效果優于其它3組處理。故確定合適的酶切反應條件為10 U用量的酶，于37℃反應12 h。

2.3 預擴增

圖4是不同引物對和不同稀釋倍數的預擴增產物電泳圖。由圖4可以看出，根據電泳條帶的強弱、范圍及雜帶的多少進行直觀分析。不同處理之間，由于連接產物稀釋濃度、預擴增引物的不同，擴增結果存在顯著差異。引物組合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠC、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RC-HpaⅡ-MspⅠC以及Eco RC-HpaⅡ-MspⅠG的擴增效果差，均出現了較為明顯的條帶，說明這些引物的擴增效果不理想，不利于后續的實驗篩選。對引物組合Eco RA-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠT、Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG、Eco RT-HpaⅡ-MspⅠA、Eco RG-HpaⅡ-MspⅠT進行比較，引物對Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG的擴增效果最好，主帶主要集中在200～300 bp，且連接產物稀釋30倍的擴增效果優于稀釋10倍和20倍。因此選擇引物對Eco RA-HpaⅡ-MspⅠG組且連接產物稀釋30倍為最佳組合。

2.4 選擇性擴增與銀染結果

根據預試驗的初步篩選，采用Eco R-AN和HpaⅡ-MspⅠ-GN選擇性擴增引物進行選擇性擴增（圖5、6）。由圖5可以看出，16個組合均擴增出條帶。將16對不同引物組合的選擇性擴增產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳的銀染第2次篩選（圖6），所有引物均能擴增出條帶。結合2次篩選結果，選取條帶清晰，多態性好的引物組合共6對，分別是：Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AG和HpaⅡ-MspⅠ-GG，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GC，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GA，Eco R-AC和HpaⅡ-MspI-GT，Eco R-AC和HpaⅡ-MspⅠ-GG。

3 討論

本研究通過對MSAP反應的酶切、連接、PCR擴增和引物篩選等條件的優化，建立了瓜實蠅DNA甲基化多態性檢測的技術體系，為后續瓜實蠅的環境適應機制研究提供了技術支撐。MSAP因其使用的同裂酶HpaⅡ和MspⅠ對相同序列CCGG中甲基化修飾的敏感程度不同，導致HpaⅡ/Eco RⅠ和MspⅠ/Eco RⅠ 2種酶切結果經擴增產生條帶的多態性，CCGG的甲基化修飾水平可以通過PAGE電泳譜帶的差異進行分析。因此，酶切反應的質量是關系著MSAP分析成果的關鍵步驟。酶切不完全會造成甲基化分析的不完全，而酶切過度會產生非特異性片段，導致陽性甲基化片段。這些都會在一定程度上影響MSAP分析效果。此外，在MSAP分析過程中的2個PCR反應，模板濃度以及緩沖液的量是決定擴增反應是否成功的關鍵所在，模板稀釋濃度太大或太小都會影響實驗結果，稀釋濃度過大會發生拖尾現象，稀釋濃度過小條帶無法正常顯現分析。而緩沖液的量決定著PCR反應中擴增酶能否正常的發揮，緩沖液過大或過小都會影響酶活性。

HpaⅡ可以識別并切割非甲基化和單鏈甲基化（mCCGG/GGCCh或mCmCGG/GGCC）；而MspⅠ能識別并切割非甲基化和內側甲基化位點（CmCGG/GGCC或CmCGG/GGmCC）而不能切割外側甲基化位點[15]。因此，MSAP技術在一定程度上也有局限性。陸光遠[16]在對油菜的研究中提到MSAP技術檢出的DNA胞嘧啶甲基化是基于“CCGG/GGCC”序列，而“CCGG/GGCC”位點之外的胞嘧啶序列是否進行了修飾不在該方法檢測之內，但因為90%左右的胞嘧啶甲基化修飾發生在“CpG”二核苷酸或“CpNpG”三核苷酸區域內，因此，基于“CCGG/GGCC”序列研究基因組DNA或基因胞嘧啶甲基化修飾的MSAP是能夠在一定程度上反應物種基因組甲基化修飾水平的[17]。另外，MSAP技術是基于AFLP技術發展而來，故還具有以下多方面的優勢[18]：（1）可以用于研究非模式生物，甚至包括那些缺少基因組測序的物種。（2）該技術具有較好的成本效益，較容易按比例增加，而且相同的試劑能夠用于不同的物種研究。（3）可以在多個位點對大量個體進行批量篩選，從而產生大量的數據來檢測種群和處理中發生的突變與分化。（4）該技術對環境誘導的DNA甲基化變異的檢測靈敏度高。因此，盡管MSAP在結果推理上具有一定的局限性，但該技術非常具有潛力。

瓜實蠅是中國南方瓜菜生產上的重要害蟲，已廣泛分布于中國多個省份，每年造成巨大的經濟損失和生態環境影響。雖然已對瓜實蠅的生態學、生物學以及生理生化等特性進行了報道，然而瓜實蠅的危害、環境適應及基因表達調控等分子機理的研究鮮有報道。MSAP能夠有效地檢測到物種種群內或種群間的DNA甲基化差異與表觀遺傳變異，從而為解析瓜實蠅如何適應外界環境因子的影響提供新的途徑。而MSAP又能產生差異性的DNA片段，通過測序可能獲得響應基因的重要信息，從而使得基因與表型聯系在一起，為深入探討瓜實蠅基因表達調控與表型提供了重要的研究方向。由此可見，DNA甲基化在生物個體應對環境變化中發揮著重要作用。建立瓜實蠅DNA甲基化的分析技術具有重要意義。本研究建立并優化瓜實蠅MSAP分析技術，為不同條件下瓜實蠅基因組DNA甲基化多態性位點的研究奠定基礎。

參考文獻

[1] 谷世偉，曾 玲，梁廣文.華南地區瓜實蠅田間種群的抗藥性監測[J].華南農業大學學報，2015（4）：76-80.

[2] Hu J， Zhang J L， Nardi F， et al. Population genetic structure of the melon fly， Bactrocera cucurbitae （Diptera： Tephritidae）， from China and Southeast Asia[J]. Genetica， 2008， 134（3）： 319-324.

[3] 陳海東，周昌清，楊平均，等.瓜實蠅、桔小實蠅、南瓜實蠅在廣州地區的種群動態[J]. 植物保護學報，1995（4）：348-354.

[4] Nishida T，Bess H A. Applied ecology in melon fly control [J]. Journal of Economic Entomology，1950， 43（6）： 877-883.

[5] 歐劍峰，黃 鴻，吳 華，等. 瓜實蠅國內研究概況[J]. 長江蔬菜，2008，（13）：33-37.

[6] 許桓瑜，何衍彪，詹儒林，等.我國南方實蠅類害蟲概述[J]. 熱帶農業科學，2015，（3）：62-69.

[7] Dhillon M K， Singh R， Naresh J S， et al. The melon fruit fly， Bactrocera cucurbitae： a review of its biology and management[J]. Journal of insect science， 2005（5）： 40.

[8] Xiong L Z， Xu C G， Saghai Maroof M A， et al. Patterns of cytosine methylation in an elite rice hybrid and its parental lines， detected by a methylation-sensitive amplification polymorphism technique [J]. Molecular and General Genetics， 1999， 261（3）： 439-446.

[9] Fang J G， Chao C T. Methylation-Sensitive Amplification Polymorphism in Date Palms （Phoenix dactylifera L.） and their Off-Shoot [J]. Plant Biology，2007， 9（4）： 526-533.

[10] 李海林，李維國，陳組興，等. 橡膠樹MSAP技術體系的優化與建立[J]. 熱帶作物學報，2011（4）：644-647.

[11] 郭欣欣，毛 雪，張 敏. 基于果蠅DNA甲基化的AFLP體系的建立及優化[J]. 生命科學研究，2011，（1）：6-12.

[12] 張 梅，陳佳林，周曉穗，等. MSAP在水稻害蟲白背飛虱中的應用研究[J]. 中山大學學報（自然科學版），2015（1）：98-102.

[13] Glastad K M， Hunt B G， Goodisman M A D. DNA Methylation and Chromatin Organization in Insects：Insights from the Ant Camponotus floridanus[J]. Genome Biology and Evolution， 2015， 7（4）： 931-942.

[14] An Z W， Xie L L， Cheng H， et al. A silver staining procedure for nucleic acids in polyacrylamide gels without fixation and pretreatment[J]. Analytical Biochemistry， 2009， 391（1）： 77-79.

[15] Mcclelland M， Nelson M， Raschke E. Effect of site-specific modification on restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases[J]. Nucleic Acids Res， 1994， 22（17）： 3 640-3 659.

[16] 陸光遠，伍曉明，陳碧云，等.油菜種子萌發過程中DNA甲基化的MSAP分析[J].科學通報，2005（24）：2 750-2 756.

[17] Salmon A， Ainouche M L， Wendel J F. Genetic and epigenetic consequences of recent hybridization and polyploidy in Spartina（Poaceae）[J]. Molecular ecology， 2005， 14（4）： 1 163-1 175.

[18] Schrey A W， Alvarez M， Foust C M， et al. Ecological Epigenetics：Beyond MS-AFLP [J]. Integrative and Comparative Biology， 2013， 53（2）： 340-350.