飼料發酵對豬糞厭氧堆肥發酵過程中酶活的影響

盛清凱 夏冬 孟憲利 韓紅 趙紅波 李祥明

摘 要：為促進種養結合，研究飼料發酵對豬糞堆肥厭氧發酵的影響。試驗分為三組，對照組為飼喂干粉料的母豬糞，試驗Ⅰ組為干粉料母豬糞+混合菌（枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌），試驗Ⅱ組為飼喂混合菌厭氧發酵飼料的母豬糞。不同豬糞分別與小麥殼混勻后堆積厭氧發酵。結果表明：飼料發酵使飼料和新鮮豬糞中乳酸菌增加，大腸桿菌減少（P<0.01），纖維素酶活性增加（P<0.05）；堆肥過程中，試驗Ⅰ組和Ⅱ組纖維素酶、蛋白酶、脲酶的活性先降低然后逐漸升高，兩組變化趨勢相似（P<0.05）。飼料發酵影響堆肥中酶的活性，發酵飼料豬糞容易腐熟，枯草芽孢桿菌可能在生豬飼料發酵及堆肥發酵整個過程中發揮作用。

關鍵詞：發酵飼料；豬糞；堆肥；纖維素酶；枯草芽孢桿菌

中圖分類號：S816.6文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0111-05

Abstract To promote the combination of cropping and livestock farming， the effects of feed fermentation on enzyme activities in pig feces during anaerobic composting fermentation were investigated. The test contained three groups， the control group was feces of sows fed with dry mash， the group Ⅰ was feces added mixed bacteria （Bacillus subtilis and Lactobacillus plantarum）， and the group Ⅱ was feces of sows fed with wet diet anaerobically fermented by mixed bacteria. The feces were respectively anaerobically fermented after mixed with wheat shells. The results showed that feed fermentation increased the lactic acid bacteria contents in feed and fresh feces， while the E. coli contents decreased （P<0.01）， and the cellulase activity increased （P<0.05）. The variation trends of cellulase， protease and urease in group Ⅰ and Ⅱ were similar during the composting process （P<0.05）. The results indicated that feed fermentation affected the enzyme activities in composting， the feces of fermented feed was easy to compost and Bacillus subtilis might play a key role in the whole process of feed fermentation and composting fermentation.

Key words Feed fermentation； Pig feces； Composting； Cellulase； Bacillus subtilis

畜禽養殖業的發展在提高人們生活水平的同時所帶來的養殖污染也日益引起人們的重視。畜禽糞便作為動物的排泄物，其組分及含量受飼料中蛋白質含量及益生菌的影響[1～3]。同時畜禽糞便含有作物生長所需的氮磷鉀等多種營養元素和有機質，又是重要的有機肥資源，其變化還影響著糞肥等后續產品的加工及質量[4]。堆肥是常用的一種處理糞便的方法，通過堆肥可實現畜禽糞便無害化和有機肥生產的統一，是養殖業和種植業的對接技術之一。從飼料生產這一源頭開始研究飼料對糞便堆肥的影響有助于養殖、種植業的結合。

飼料中添加外源菌厭氧發酵后，有益菌擴繁，淀粉酶、蛋白酶等酶活升高，豬生產性能提高，豬糞中的菌群發生變化，糞便中氮磷被降解及減排，臭味降低[5，6]。飼料發酵對糞便堆肥的影響尚不清楚。由于飼料發酵及堆肥發酵都是在微生物作用下完成的，飼料發酵中的微生物可能通過微生物自身或微生物分泌的酶制劑等產物影響著體外豬糞的堆積發酵。酶作為微生物分泌的產物，分解豬糞中的纖維素、蛋白質等物質，其活性可作為判定豬糞堆制過程中腐熟程度的定量生化指標[7]。本研究就發酵飼料對豬糞堆肥發酵中酶活的影響進行探析，以期為養殖污染治理及糞便的資源化利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和材料

體況相近、產仔數相近、產3胎的大×長二元健康、妊娠1天的母豬120頭，由臨邑綠葉種豬場提供。枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌皆由山東省農業科學院畜牧獸醫研究所提供，其含量均為1×109 cfu/g，添加劑量為0.05%。小麥殼由市場購買。

1.2 試驗設計

將母豬隨機均分為對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組，單欄飼養。對照組和試驗Ⅰ組母豬飼喂母豬干粉狀全價配合飼料，試驗Ⅱ組飼喂以母豬干粉狀全價配合飼料為基礎的發酵濕料。發酵濕料制作方法為將母豬干粉狀全價配合飼料與枯草芽孢桿菌和乳酸菌混合后塑料袋厭氧發酵[8]。發酵成熟后開始飼喂。生豬由專人飼喂，干清糞法分別收集不同組的新鮮糞便，將其各自與小麥殼按1∶1體積比混勻后裝入直徑為1.0 m、高度為1.5 m的避光密封塑料桶中厭氧發酵。每組3個桶。試驗Ⅰ組小麥殼中添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌，添加劑量為0.05%，對照組和試驗Ⅱ組的小麥殼中不添加枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌。

1.3 取樣

生豬飼喂1個月后在10處代表性位點收集對照組和試驗Ⅱ組飼料樣品（n=10），進行細菌和酶活指標檢測。同期對照組、試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組每組隨機選取10頭早7∶00空腹收集生豬新鮮糞便（n=10），其中對照組和試驗Ⅰ組進行菌群、pH及酶活等相關指標檢測。然后將三組新鮮豬糞分別與小麥殼混勻填入塑料桶進行厭氧發酵，厭氧發酵時每桶選取代表性位點4處每隔3天測定一次表面20 cm深處的發酵溫度（n=12），每隔6天每桶中選取4處代表性位點取樣對發酵豬糞的發酵溫度、酶活進行分析（n=12）。

1.4 檢測指標及方法

飼料和糞便及堆肥中酶活性的測定：將樣品與水按重量比1∶6比例稀釋，0.45 μm過濾，取濾液按照試劑盒說明進行測定。纖維素酶、中性蛋白酶、脲酶及過氧化氫酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所。同時取濾液測定pH值。

乳酸菌、大腸桿菌采用平板計數法計數。

1.5 數據處理

采用SAS （ V 9.1） 軟件對所有數據進行處理，飼料和豬糞中的數據采用t-test進行t檢驗，厭氧發酵過程中的數據采用ON-WAY ANNOVA進行方差分析，用Student-Newmnan-Keuls法進行多重比較，P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。不同酶活的相關性采用CORR程序分析。數據結果用平均數±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 飼料發酵對飼料和新鮮豬糞菌群及酶活的影響

由表1可見，和對照組相比，試驗Ⅱ組飼料中的乳酸桿菌含量、纖維素酶酶活極顯著升高（P<0.01），中性蛋白酶和脲酶的活性顯著升高（P<0.05），大腸桿菌含量極顯著降低（P<0.01）。試驗Ⅱ組豬糞中的乳酸桿菌含量極顯著增加（P<0.01），纖維素酶活性顯著增加（P<0.05），大腸桿菌含量極顯著降低（P<0.01），中性蛋白酶及脲酶無顯著變化（P>0.05）。結果表明，飼料發酵改變了飼料中的微生物菌群及酶活性，并且影響豬糞中的菌群及酶活。

2.2 飼料發酵對飼料和豬糞以及厭氧發酵豬糞pH值的影響

由表2可見，和對照組相比，試驗Ⅱ組飼料pH值顯著降低，新鮮豬糞pH值顯著升高（P<0.05）。在豬糞厭氧發酵的第6、18、30天試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組pH值顯著高于對照組（P<0.05），兩試驗組之間無顯著差異（P>0.05）。結果表明，飼料發酵影響飼料和新鮮豬糞以及厭氧發酵豬糞的pH值。

2.3 飼料發酵對厭氧發酵豬糞發酵溫度的影響

由圖1可見，隨著發酵時間的延長，三組豬糞的發酵溫度逐漸升高，維持一段時間高峰，后逐漸降低。高峰期及試驗結束時試驗Ⅱ組的發酵溫度顯著高于試驗Ⅰ組，試驗Ⅰ組顯著高于對照組（P<0.05）。結果表明，飼料發酵的豬糞和添加外源菌的豬糞易于發酵。

2.4 飼料發酵對厭氧發酵豬糞酶活的影響

隨著發酵的進行，試驗Ⅱ組和試驗Ⅰ組豬糞中纖維素酶酶活變化趨勢相似，皆是6天后逐漸降低，然后略微升高再降低；而對照組則是先升高，維持一定高峰期，然后降低（圖2）。中性蛋白酶酶活的變化（圖3）與纖維素酶相似。試驗Ⅱ組和試驗Ⅰ組豬糞中脲酶皆是逐漸降低，發酵24天后略有升高。對照組則是先升高再降低再升高再降低（圖4）。對照組過氧化氫酶酶活逐漸降低，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組過氧化氫酶酶活第18天前逐漸降低，而后逐漸升高。第6天試驗Ⅰ組酶活極顯著高于試驗Ⅱ組（P<0.01），顯著高于對照組（P<0.05）。第24、30天試驗Ⅰ組與試驗Ⅱ組無顯著差異（圖5）。結果表明，飼料發酵和豬糞中添加外源菌影響厭氧發酵豬糞中纖維素酶、蛋白酶、脲酶和過氧化氫酶的活性。

2.5 不同處理豬糞中酶的相關性

試驗Ⅰ組和Ⅱ組兩組中纖維素酶、中性蛋白酶、脲酶及過氧化氫酶達到顯著或極顯著相關。表明，發酵飼料豬糞和添加外源菌豬糞在堆肥發酵過程中兩組酶的變化趨勢相似。

3 結論與討論

為了提高豬糞堆肥發酵的效果，堆肥發酵前常常添加外源菌。本試驗中發酵飼料的豬糞與添加外源菌的豬糞發酵過程中酶活變化類似，表明發酵飼料的豬糞容易堆肥發酵，發酵飼料的豬糞在堆積厭氧發酵時可以不必再添加外源菌，有機肥的生產受飼料發酵影響。

飼料發酵后，發酵飼料和發酵飼料豬糞中的菌群發生改變，影響后續的堆肥發酵。飼料厭氧發酵后，乳酸菌增加，大腸桿菌降低，飼料中的菌群發生變化，這與楊學海等[9]結果相似。枯草芽孢桿菌分泌纖維素酶[10]、蛋白酶、淀粉酶[11]等，導致發酵飼料中纖維素酶、蛋白酶活性升高。植物乳桿菌作為一種乳酸菌，分泌乳酸、降低飼料pH值。枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌共同影響飼料中的菌群。發酵飼料豬糞中菌群改變的原因可能基于以下幾個方面，其一，發酵飼料中枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的影響。由于枯草芽孢桿菌為兼性厭氧菌，植物乳桿菌為厭氧菌，在腸道厭氧環境中可以發揮益生菌的功能，導致腸道菌群改變[12]。其二，發酵飼料中有機酸的影響。植物乳桿菌分泌的乳酸以及飼料碳水化合物降解產生的乳酸等酸化劑，可以增加腸道中乳酸菌的數量，降低大腸桿菌的含量[13]。其三，發酵飼料中的纖維素酶、蛋白酶等酶制劑的影響。飼料中添加纖維素酶等復合酶制劑，可以減少糞氮的含量，促進豬的消化，可能間接影響腸道或糞便中的菌群[14]。糞便中菌群的變化，導致發酵飼料的豬糞易于發酵，這與牛糞、豬糞因糞便菌群不同導致厭氧發酵效果差異的報道類似[15]。

本試驗堆肥過程中隨溫度的變化，不同種類的酶活發生了不同變化，這與古潔[16]的報道相似。酶活變化的原因可能主要與外源枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌有關。枯草芽孢桿菌能形成芽孢，抗逆性強，耐高溫及酸堿，在飼料發酵過程中分泌纖維素酶、蛋白酶等酶制劑，經過動物胃腸道的厭氧環境，仍然可以在堆肥過程中發揮作用[17]。盛清凱等[18]在飼料中添加枯草芽孢桿菌后不但降低了豬糞中大腸桿菌的含量，而且降低豬糞體外發酵液中臭氣的濃度。植物乳桿菌作為一種乳酸菌，最適生長溫度為30～35℃，不耐高溫，分泌谷胱甘肽過氧化物酶、總超氧化物歧化酶等，具有清除自由基的功能[19]。枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌的擴繁，可能導致發酵初期纖維素酶、蛋白酶、過氧化氫酶等酶活性增加。由于枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌的耐熱性能差異，植物乳桿菌可能在堆肥發酵初期發揮作用，枯草芽孢桿菌可能在整個堆肥發酵過程中發揮作用，這與接種菌劑不同、堆肥發酵效果不同的研究結果類似[17]。

堆肥過程酶活變化的原因也可能與糞肥腐熟過程中的高溫有關。酶作為一種蛋白質，其活性受環境溫度影響。不同的酶制劑各有其不同的溫度范圍。纖維素酶作用的適宜溫度一般為26～31℃。發酵初期糞肥發酵溫度低，中期發酵溫度高，后期發酵溫度降低。試驗中期發酵飼料豬糞發酵溫度高于對照組，高溫可能降低了酶活性。徐智等[20]報道，堆肥過程中纖維素酶、蛋白酶等酶的活性受堆肥溫度顯著影響。酶活性也受環境pH值影響，不同堆肥發酵溫度下不同pH值對酶活的影響有待進一步研究。

本試驗為室外堆肥發酵，發酵過程中突遇降溫天氣，這可能降低了發酵第18天時的堆肥溫度及影響了堆肥腐熟過程中酶的活性。飼料中枯草芽孢桿菌分泌的不同酶制劑分解蛋白質、纖維素等產物對豬糞中鏈球菌、氮磷及pH值等的影響也有待深入研究。

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