響應面法優化生防枯草芽孢桿菌B579固相發酵工藝

孫冰冰 楊秀榮 郝永娟 李偉 魏軍 田濤

摘 要：為提高生防芽孢桿菌的發酵水平，利用響應面法對生防枯草芽孢桿菌B579進行固相發酵條件優化，以建立一套適合生防芽孢桿菌的固相發酵技術體系。首先通過Plackett-Burman試驗篩選出對發酵產量影響顯著的重要因素，然后進行最陡爬坡試驗逼近最大菌體產量值區域，通過Box-Behnken和響應面試驗設計，得到回歸模型，并對回歸模型進行回歸分析和實踐驗證。結果表明：對發酵產量影響顯著的3個重要因素為牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉，當其濃度分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時，發酵水平達到最高，為1.93×10¹¹cfu/g，比液相發酵水平提高了15倍；經驗證該模型準確可靠。

關鍵詞：生防芽孢桿菌；固相發酵；響應面法

中圖分類號：S482.2+92文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）05-0062-05

Abstract To enhance the fermentation level of biocontrol Bacillus， the solid-state fermentation conditions of Bacillus subtilis B579 were optimized using response surface methodology to establish the related technology system. Firstly， the Plackett-Burman experiment was applied to screen the importan influential factors， and then the path of steepest ascent was used to approach the biggest region of the cell yield. Moreover， the Box-Benhnken experimental design and response surface methodology were employed to get the regression model， which was proved through regression analysis and practice verification. The results showed that the three factors affecting fermentation production were beef extract， corn meal and soluble starch. The fermentation production reached the highest as 1.93×10¹¹cfu/g， when the content of beef extract， corn meal and soluble starch were 15.1， 10.3 and 9.14 g/kg respectively. Under the optimized fermentation conditions， the solid fermentation production of biocontrol Bacillus increased by 15 times compared to the liquid fermentation. The regression model was verified to be accurate and reliable.

Key words Biocontrol Bacillus； Solid-state fermentation； Response surface methodology

一直以來，化學農藥及肥料的使用對于植物病蟲害防治和提高農作物產量品質起到重要作用，但大量有害化合物的使用造成了土壤和地下水的嚴重污染，對生物及人類的生存也造成了嚴重危害。在過去的幾十年中，世界各國都在努力開發可替代傳統化學藥劑控制植物病蟲害的新方法，利用微生物及其代謝產物進行生物防治，被公認為是一種環境友好型的選擇。微生物生防菌劑的研究與開發已成為生物防治的一個重要內容。芽孢桿菌是土壤和植物微生態區系的優勢生物種群，許多性狀優良的菌株表現出對多種植物病原菌的拮抗作用[1～3]。生防芽孢桿菌目前已在水稻、玉米、小麥、大豆、辣椒、棉花、番茄等農作物上顯示出較好的病害防治效果[4]。芽孢桿菌被認為是最有希望的微生物菌劑候選菌群，并且進行了廣泛研究[5～7]。市場上的生防芽孢桿菌制劑多采用液相深層發酵技術。液相深層發酵投資大、成本高、技術要求高、產生廢液多、污染嚴重[8，9]。而固相發酵整個發酵過程與微生物在自然環境中所發生的微生物反應相似，可以利用工農業生產中的副產品進行發酵[10]，避免了液相發酵原材料價格較高的不足，從而降低了生產成本，此外發酵過程能耗低，沒有廢物排放，且適宜工業化生產，日益受到人們重視。

本研究以降低生產成本、促進生防菌劑的推廣使用、減少化學農藥使用為目的，以生防芽孢桿菌為供試菌株，利用農產品加工過程中的副產物菇渣（廉價且易獲得）、麥麩、豆渣作為固體發酵基質，采用響應面法優化生防芽孢桿菌的固相發酵工藝，提高發酵水平，以建立一套適合生防芽孢桿菌的固體發酵技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 生防枯草芽孢桿菌B579，由天津市植物保護研究所糧經病害研究室提供。生防芽孢桿菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363，由天津市植物保護研究所植病生防研究室從土壤中分離得到，對土傳病害（辣椒疫霉菌Phytophthora capsici、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum）有很好的拮抗作用。經16S rRNA分子鑒定，TB1340菌株初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌[11]，TB1301、TB1336和TB1363菌株的鑒定工作正在進行。

1.1.2 培養基 斜面培養基（LB培養基）：蛋白胨10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，瓊脂粉 20 g/L，pH調至6.8～7.2，121℃滅菌30 min；液體種子培養基：蛋白胨 10.00 g/L，酵母膏浸粉5.00 g/L，NaCl 5.00 g/L，pH調至6.8～7.2，121℃滅菌30 min；固相發酵培養基的配制：稱取一定量蘑菇殘渣（為主）、麥麩、大豆殘渣及其他影響因素（具體參數參見表1），pH調至6.8～7.2，加入一定量水至沒有流動水相，121℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體增殖方法 刮取LB培養基平板上培養24 h的生防芽孢桿菌B579接種到30 mL液體LB培養基中，于溫度為37℃、搖床轉速為160 r/min條件下培養12～16 h，作為種子液備用。然后以3%～5%的接種量接種到固相發酵培養基中，于37℃靜置培養72 h，每24 h搖晃一次。

1.2.2 Plackett-Burman試驗設計 Plackett-Burman試驗設計是一種兩水平的試驗設計方法，可以用最少試驗次數估計出主效應因素，適用于從眾多的試驗因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個因素。根據芽孢桿菌生長所需要的營養條件，通過查閱文獻及前期試驗，選取10個影響因素，每個影響因素取高（+）、低（-）兩個水平，以菌體產量（Y）為響應值，采用中心點為3、N=15的Plackett-Burman試驗設計。各參數及其水平見表1。

1.2.3 最陡爬坡試驗設計（steepest ascent design） 最陡爬坡試驗以試驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值大小確定變化步長，能快速經濟地逼近最佳值區域。根據Plackett-Burman試驗結果各顯著影響因素效應的大小設定步長及變化方向，正效應因素取較高值，負效應因素取較低值。

1.2.4 Box-Behnken試驗設計 本試驗確定出3個關鍵因素對響應值有重要影響，每個因素取3個水平，以（-1，0，1）編碼，根據相應的實驗表進行試驗后，對數據進行二次回歸擬合，得到包括一次項、平方項和交互項的二次方程，分析各因素的主效應和交互效應，最后在一定水平范圍內求取最佳值。經回歸擬合，各試驗因子對響應值的影響可以用下列函數表示：

1.2.5 回歸模型擬合優化的驗證 通過響應面優化方法得到的最優固相發酵條件，對生防芽孢桿菌B579以及本實驗室由蔬菜根際土壤分離的對土傳病害具有較好拮抗作用的芽孢桿菌TB1301、TB1336、TB1340、TB1363進行回歸模型可靠性驗證。每個試驗重復3次，對應的響應值取平均值。

1.2.6 生防芽孢桿菌固相發酵水平測定 生防芽孢桿菌固相發酵水平以其菌體量來測定，采用細菌菌落總數測定法[12]。

1.3 數據分析

采用軟件Design-expert.v 8.0.6進行試驗設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 影響芽孢桿菌固相發酵水平的重要因素篩選

Plackett-Burman試驗設計表及試驗結果見表2。Plackett-Burman試驗各因素參數分析見表3。從表3的概率值（P<0.0001）大小可以看出，對枯草芽孢桿菌固相發酵水平具有顯著影響的因素是牛肉膏（X1）、玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6），可作為主要因素考慮進一步做響應面試驗。其中牛肉膏（X1）為負效應因子，在進一步的最陡爬坡試驗中取其較小值，玉米粉（X4）和可溶性淀粉（X6）為正效應因子，因此在最陡爬坡試驗中均取其較大值。

2.2 最陡爬坡試驗設計及其結果

表4中列出了顯著影響因子的變化方向、步長及其試驗結果。結果表明：菌體產量在0～0+4△之間先明顯上升后開始下降，當牛肉膏為15.5 g/kg、玉米粉為10.0 g/kg、可溶性淀粉為9.1 g/kg時固相發酵水平達到最大，為三因素的最大響應值區域，故以此條件為進一步響應面試驗中心點。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

根據最陡爬坡試驗設計結果確定3個重要因子的最佳濃度范圍后，以牛肉膏為15.5 g/kg、玉米粉為10.0 g/kg、可溶性淀粉為9.1 g/kg為試驗中心點進行響應面分析。Box-Behnken試驗設計因子編碼水平見表5，試驗設計及結果見表6。

利用軟件Design-expert.v 8.0.6對Box-Behnken試驗結果進行二次多項式回歸擬合，得到生防芽孢桿菌固相發酵水平對牛肉膏、玉米粉及可溶性淀粉的二次多項式回歸方程：

擬合回歸方程的決定系數R2=0.9823，說明該回歸模型可以解釋98.23%的試驗所得的B579固相發酵水平，表明回歸方程擬合良好，可用于預測生防芽孢桿菌固相發酵水平的實際情況。

由回歸方程系數顯著性檢驗（P<0.05，見表7）得知，模型項X1、X4、X6、X4X6、X42、X62對回歸模型影響顯著。

圖1、圖2和圖3繪制了回歸方程的三維響應面分析圖及對應的等高線圖，每個響應面分別代表兩個獨立影響因子間的相互作用，而此時第三個因子保持在編碼0的水平。從響應面圖可以看出：在固相發酵試驗中，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的添加濃度和發酵水平存在顯著相關性，同時可以發現兩兩影響因子之間存在一定相互作用，對發酵水平的影響不是直觀的線性關系。根據回歸方程在各影響因子取值范圍內求解最優值得出，在X1、X4 和X6的值分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時，發酵水平達到最高，為1.93×10¹¹cfu/g。

2.4 響應面模型驗證

根據回歸方程得出的固相發酵水平的極值點進行模型驗證，在優化的培養條件下對本實驗室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363進行固相發酵小試，所得發酵產量分別為1.94×10¹¹、1.92×10¹¹、1.93×10¹¹、1.93 ×10¹¹cfu/g。經響應面法優化的發酵條件下的固相發酵水平與建立的響應面模型的預測值1.93×10¹¹cfu/g相接近，證明響應面法優化生防芽孢桿菌的固相發酵條件可行，所建立的回歸方程可靠。

3 結論與討論

相比傳統的液相深層發酵方法，固相發酵技術在生防芽孢桿菌研究中的應用越來越多。本試驗通過響應面分析法對生防芽孢桿菌發酵培養基及發酵條件進行優化，并對結果進行統計學上的回歸模擬和預測，經濟、準確、高效地得到最優發酵條件。研究結果表明，牛肉膏、玉米粉和可溶性淀粉的濃度分別為15.1、10.3 g/kg和9.14 g/kg時，生防芽孢桿菌固相發酵水平達到最高，為1.93×10¹¹cfu/g。相比枯草芽孢桿菌B579液相發酵水平1.23×10¹⁰cfu/mL提高了15倍[13]。經過本實驗室自有菌株TB1301、TB1336、TB1340、TB1363固相發酵小試充分驗證了回歸模型的可靠性、準確性，不僅說明了利用響應面法優化生防芽孢桿菌固相發酵工藝可行，而且其所建立的固相發酵技術體系對生防芽孢桿菌具有普遍適用性。生防芽孢桿菌固相發酵條件的優化，為生防菌的中試發酵生產與示范提供了技術支持，有效推動了生防菌劑的開發和應用。

參 考 文 獻：

[1] Asaka O， Shoda M. Biocontrol of Rhizoctonia solani damping off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J].Applied and Environmental Microbiology， 1996，62（11）：4081-4085.

[2] 陳志誼，高太東，嚴大富，等.枯草芽孢桿菌B-916防治水稻紋枯病的田間試驗[J].中國生物防治，1997，13（2）：75-78.

[3] 程亮，游春平，肖愛萍.拮抗細菌的研究進展[J].江西農業大學學報，2003，25（5）：732-737.

[4] 周曉梅，劉強，王瑛璐.拮抗菌生物防治農作物病害的研究進展[J].吉林師范大學學報，2010，36（1）：36-39.

[5] 陳中義，張杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機制與遺傳改良研究[J].植物病理學報，2003，33（2）：97-103.

[6] 陳志誼，劉永鋒，陸凡.水稻紋枯病生防菌Bs-916產業化生產關鍵技術[J].植物保護學報，2004（4）：230-234.

[7] Emmert E A B， Handelaman J. Biocontrol of plant disease： a （Gram-） positive perspective[J]. FEMS Microbiol Letters，1999，171：1-9.

[8] 李晶，楊謙.生防枯草芽孢桿菌的研究進展[J].安徽農業科學，2008，36（1）：106-111.

[9] 俞俊棠.新編生物工藝學[M].北京：化學工業出版社，2003.

[10]徐福建，陳洪章，李佐虎.固態發酵工程研究進展[J].生物工程進展，2002，22（1）：44-48.

[11]孫冰冰，段紅英，李偉，等.辣椒疫霉菌拮抗細菌的篩選、鑒定及防效測定[J].山東科學，2014，27（3）：23-29.

[12]杜連祥，路福平.微生物學實驗技術[M].北京：中國輕工業出版社，2006：68-73.

[13]王雪蓮，王敏，駱健美，等.枯草芽孢桿菌生防菌B579最佳培養基響應面法優化[J].江蘇農業學報，2009，25（1）：212-215.