譜技術在臨床常見呼吸道病原菌檢測和鑒定中的應用進展

倪麗麗　陳晉

質譜（mass spectrometry）技術是一種測量離子荷質比（電荷-質量比）的分析方法，可用來分析同位素、元素成分及有機物構造等。質譜儀最早的臨床應用主要在于檢測一些生物標記物以幫助診斷癌癥和遺傳疾病等。20 世紀80年代，日本島津公司的田中耕一發明了基質輔助激光解析電離（matrix assisted laser desorption ionization，MALDI）技術，使得質譜能夠檢測生物大分子[1，2]，該發明在2002年榮獲諾貝爾獎。質譜技術的誕生和發展奠定了用蛋白質指紋圖譜鑒定微生物的基礎，通過檢測未知微生物的蛋白質指紋圖譜并與質譜圖數據庫中特征性譜圖進行比對，從而對待測微生物進行快速鑒定。由于測定的圖譜中主要的分子離子峰為菌體內高豐度，且表達穩定、進化保守的核糖體蛋白，因而此法不但鑒定結果精確度高，且能借助聚類剖析獲取微生物間的進化與親緣關系。

1 鑒定原理

MALDI-TOF MS的作用機理是把微生物樣品同等量基質溶液聯合或分別加入樣品靶盤中，溶劑揮發后產生共結晶；借助激光輻射結晶體，基質吸收激光能量使樣品吸附，產生電荷轉移后游離樣品分子，樣品離子于加速電場下得到動能，繼而進行質量評估，將離子峰與離子質荷比設為縱橫坐標，產生質量圖譜；通過軟件分析比較，篩選并確定出特異性指紋圖譜，從而實現對目標微生物種或菌株的區分和鑒定[3]。該技術具有速度快，靈敏度高，操作簡單，信息直觀，成本低廉等特點，在對病原微生物進行快速鑒定方面具有良好的應用前景。

2 質譜儀在臨床常見呼吸道病原菌鑒定中的應用

1996年，HOLLAND等[4]首次報道了細菌不經前處理直接進行質譜分析，可得到完整細胞的MALDI-TOF MS指紋圖譜。KRISHNAMURTHY等研究人員用質譜順利完成了對細菌種屬水平的鑒定。在質譜技術逐漸成熟期間，相關MALDI-TOF MS高效、精確鑒定的研究報道也逐漸變多。當下，臨床應用最廣的質譜儀是MALDI BioTYPER TM（Bruker Daltonics），SARAMISTM（Shimadzu & Anagnostec）和MALDI micro MXTM（Waters Corparation）、VITRK MSTM（BIOmERIEUX）。其中，MALDI BioTYPER TM于2011年榮獲歐洲CE認證；VITRK MSTM于2011年榮獲歐盟體外診斷認證及美國FDA準入，且在2012年8月通過SFDA批準，這就意味著MALDI-TOF MS質譜技術將在臨床微生物診斷中獲得廣泛應用。

2.1常見呼吸道細菌鑒定 大量文獻報道，MALDI-TOF MS對細菌鑒定到種屬水平正確率較高，報道了臨床呼吸道中的常見的銅綠假單胞菌、嗜血桿菌肺炎鏈球菌大腸埃希氏菌和葡萄球菌等重要病原菌成功鑒定的實例，體現了這一技術在臨床病原菌鑒定中的應用前景。質譜用于細菌鑒定正確率高，應用范圍廣，且方法和配套數據庫較為成熟。

Microflex LT（BioTyper）和Vitek MS IVD（Vitek MS）兩種質譜系統分別鑒定986 株臨床需鑒定到種水平的細菌，結果顯示BioTyper與Vitek MS的鑒定正確率相當，分別為97.2%和93.2%（P=0.608）[5]，大多數用MALDI-TOF MS不能正確鑒定的都是一些相近的菌株。Blondiaux等[6]也得出類似結論。且不同質譜系統對同一類型細菌的鑒定精確度也不盡一致。

Eigner 等[7]報道了對1116株臨床分離菌和108株標準菌株的回顧性分析。通過MALDI-TOF MS Bio Typer 數據庫同傳統細菌鑒定進行對比，得出對標準菌株鑒定的精確度是93.5%，臨床分離株的鑒定精確度是95.2%，對腸球菌、葡萄球菌、腸桿菌、鏈球菌、不發酵革蘭陰性桿菌的鑒定精確度依次是100%、99.5%、95.5%、93.7%和79.7%.

嗜血桿菌的鑒定一直是臨床微生物實驗室的難題，臨床實驗室鑒定主要依賴手工方法，MALDI-TOF MS的應用使嗜血桿菌鑒定變得更加簡便且快速。BioTyper與Vitek MS對流感嗜血桿菌的鑒定精確度都是100%，但二者對副流感嗜血桿菌的鑒定都不精確，2株菌株都鑒定失敗[5]。實驗室鑒別流感嗜血桿菌、溶血性嗜血桿菌的常規方法并不可取，溶血性嗜血桿菌常被鑒定為未分型流感嗜血桿菌，應用BioTyper 鑒定的精確度則是99.6%[7]。

在非結核分枝桿菌鑒定方面，國外學者對107株分枝桿菌臨床分離株（包括結核分枝桿菌復合體），利用聲波降解的熱失活方法和利用玻璃珠進行細胞裂解的方法進行失活和提取，再利用MALDI-TOF MS方法進行鑒定，發現兩種方法在種/屬水平上成功鑒定率分別為82.2%和88.8%。周昭彥[13]等采用MALDI-TOF MS對83株非結核分枝桿菌（臨床分離非結核分枝桿菌15 株和醫院供水系統環境分離非結核分枝桿菌68株）進行快速鑒定方法及其可行性、準確性和重復性進行研究，并得出結論認為MALDI-TOF MS可快速準確地鑒定臨床和環境分離的非結核分枝桿菌，在臨床實驗室常規鑒定方面有著較好的應用前景。

2.2常見呼吸道真菌及酵母菌鑒定 MALDI-TOF MS鑒定臨床分離真菌，近幾年，廣譜抗生素應用率逐漸提升，真菌感染占比不斷提升，因真菌感染而病死的患者數量也非常高。所以，提升真菌鑒定技術非常關鍵。MALDI-TOF MS鑒定真菌的精準度高于常規鑒定法，對絲狀真菌、酵母菌的鑒定精準度依次是100%、97.9%[8]。Marklein [9]等用MALDI-TOF MS 的方法了267 株臨床分離的酵母菌和類酵母真菌，247（92.5%）株得到了準確的菌種鑒定結果。Tan等[10]準確鑒定了952 株臨床分離株中的128 株酵母菌分離株。Bille 等[20]用MALDI-TOF MS 鑒定酵母菌和曲霉屬真菌的準確率分別為98.8% （160/162）和98.4%（63/64）。

3 直接從臨床標本中檢測微生物

應用MALDI-TOF MS直接鑒定陽性血培養標本中的細菌和真菌可以極大地提高檢測速度。大量的研究嘗試用不同的方法來處理血標本，由于血培養基各異、數據庫和分析軟件等差異都對樣本前處理的方法標準化造成了一定的困難。布魯克公司研發了血培養標本的前處理試劑盒，用于陽性血培養標本直接質譜鑒定的前處理。Kok等使用MALDI SepsityperTM試劑盒對507例血培養陽性的培養液直接進行MALDI-TOF MS檢測[9]，可以正確鑒定出379例，占74.8%，其中358例為單一病原菌，21例為混合感染。這些研究結果也促進了MALDI-TOF MS應用于其他液體培養細菌快速鑒定的研究。Ferreira等用MALDI-TOF MS鑒定220份細菌數>105CFU/ml的尿液標本，得出種和屬的精確度依次是91.8%、92.7%。

4 檢測細菌耐藥性

質譜技術檢測病原菌耐藥性：除快速鑒定外，質譜技術也被嘗試用于檢測一些臨床常見的耐藥基因，例如耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌等的識別，鮑曼不動桿菌相關的耐藥機制與產生條件等，為控制耐藥菌株播散流行及治療提供新的策略。現今，對細菌耐藥性的檢測主要集中在以下幾個方向：檢測降解酶對抗生素的修飾、通過對多重耐藥菌的蛋白質組學研究其耐藥機制的決定因素以及對某些靶位點如核糖體甲基化位點的分析[11]。Jung 等[12]用MALDI-TOF MS 的方法快速檢測抗β-內酰胺類抗生素的腸桿菌科細菌。通過檢測100 例經血培養得到的抗三代頭孢霉素的腸桿科細菌所表達的β-內酰胺酶，并用傳統方法對檢測結果進行了驗證，用MALDI-TOF MS的方法鑒定青霉素敏感株和耐藥株的敏感性和特異性均為100%。

5 在實驗室應用的不足與展望

5.1缺陷和改進 MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室中具有較高應用價值，但仍有缺陷。部分遺傳背景類似的菌株存在交叉鑒定，例如大腸桿菌與志賀菌；部分細菌因標準圖譜、分類不完善使鑒定精確度變低；部分菌株的鑒定得經蛋白提取方可完成；等等。分析鑒定精確度的差異性，多因個別菌株參考圖譜不完整所致，所以持續更新參考圖譜是提升MALDI-TOF MS鑒定精確度的重點。

5.2展望 MALDI-TOF MS不但可用于微生物種屬水平鑒定，也可用于微生物分型與亞種水平鑒定。沙門菌等細菌的血清分型流程較復雜，試劑盒成本較高，且需較多人力與物力的投資。MALDI-TOF MS的應用可讓細菌初步分型，繼而確證血清學，省時省力，也可節約資源。但此應用挑戰性較高，需要辨別更多質譜峰，樣品準備流程也較嚴格，還得綜合分析圖像，操作流程嚴謹性更高。

MALDI-TOF MS 方法簡便、快捷、經濟的優勢是其在臨床微生物檢測領域具有極其廣闊的應用前景，雖然其對一些樣本的鑒定還存在些許的局限性，相信隨著質譜效果好，重復性高的通用試驗試驗方法的建立，以及質譜圖數據庫的建立和質譜技術的發展另外MALDI-TOF MS與其他分子生物學檢測技術聯合，可以對臨床產酶菌株的檢測方法、基因分型及測序、蛋白質組學方面開展更加深入的研究，MALDI-TOF MS 的方法必將成為臨床微生物鑒定的重要工具。

參考文獻：

[1] Karas M，Bachmann D，Bahr U，et al.Matrix assisted ultraviolet laser desorption of non-compounds [J].Int J Mass Spectrom Ion Process ，1987，78：53-68.

[2] Tanaka K，Waki H，Ido Y，et al.Protein and polymer analysis up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometey [J].Rapid Commun Mass Spectrom ，1988，2：151-153.

[3] Fenselau C，Demirev PA.Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spevtrometry [J].Mass Spectrom Rev，2011，20（4）：157-171.

[4] Garcfa P ，Allender F，Legarraga P，et al.Bacteria identification based on protein mass spectrometry ：A new insight at the microbiology of the 21 st century[J].Rev Chilena Infectol，2012，29（3）：263-272.

[5]MARTINY D，BUSSON L，WYBO I，et al.Comparison of the Microflex LT and Vitek MS systems for routine indentification of bacteria by matrix -assisted laser desorption ionization -time of flight mass spectrometry [J].J Clin Microbiol，2012，50（4）：1313-1325.

[6]Blondiaux N，Gaillot O，Courcol RJ.MALDJ-TOF mass spectrometry to identify clinical bacterial isolate：Evaluation in a teaching hospital in Lille [J].Pathol Biol，2010，58（1）：55-57.

[7]BRUIN J P，KOSTRZEWA M，VAN DER ENDE A，et al.Identification of Haemophilus influenza and Haemophilus haemolyticus by matri-assisted laser desorption ionization -time od flight mass spectrometry [J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2014，32（2）：279-284.

[8]IRIART X，LAVERGNE R A，FILLAUX J，et al.Routine identification of medical fungi by the new Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight system with a new time effective strangey [J].J Clin Microbiol，2012，50（6）：2107-2110.

[9]Kok J，Thomas LC，Olma T，et al.Identification of bacteria in blood culture broths using matrix-assisited laser desorption-ionization Sepsityper TM and time of flight mass spectrometry[J].PlaS One，2011，6（8）：e23285.

[10]Ferreira L，Sanchez-Juanes F，Gonzalez-Avila M，et al.Direct identification of urinary tract pathogens from urine samples by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol，2010，48（6）：2110-2115.

[11]Hrabak J，Chudackova E，Walkova R.Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight（maldi-tof） mass spectrometry for detection of

antibiotic resistance mechanisms from research to routine diagnosis [J].Clin Microbiol Rev，2013，26（1）：103-114.

[12]Jung J S，Popp C，Sparbier K，et al.Evaluation of MALDI-TOF MS for rapid detection of beta-lactam resistance in Enterobacteriaceae derived from blood cultures [J].J Clin Microbiol，2014，52（3）：924-930.

[13]周昭彥，胡必杰，鮑容，等.MALDI-TOF 質譜快速鑒定非結核分枝桿菌方法的建立和評價[J].中華檢驗醫學雜志，2013，3：610-614.

[14]HOLLAND R D，WILKES J G，RAFII F，etal.Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using martix-assited laser desorption ionization with time of flight mass spectrometry [J].Rapid Common Mass Spectrom，1996，10（10）：1227-1232.

[15] Jacquier H，Carbonnelle E，Corvec S，etal.Revisited distribution of nonefermenting Gram-negative bacilli clinical isolates[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2011，30（12）：1579-1586.

[16] Sogawa K，Watanabe M，Sato K，tral.Use of the MALDI Bio Typer system with MALDI-TOF mass spectrometry for rapid identification of microorganisms[J].Anal Bioanal Chem，2011，400（7）：1905-1911.

[17]Eigner U，Holfelder M，Oberdorfer K，etal.Performance of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for the identification of bacterial isolates in the clinical routine laboratory [J].Clin Lab，2013，55（7-8）：289-296.

[18]E Marklein G，Josten M，Klanke U，etal.Martix-assited laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for fast and reliable identification of clinical yeast isolates [J].Clin Microbiol ，2009，47（9）：2912-2917.

[19]Tan K E，Ellis B C，Lee R，etal.Prospective evaluation of a martix-assited laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness [J].Clin Microbiol ，2012，50（10）：3301-3308.

[20]Bille E，Dauphin B，Leto J，et al.MALDI-TOF MS Andromas strategy for thr routine identification of bacteria ，mycobacteria，yeast，Aspergillus spp，and positive blood cultures [J].Clin Microbiol Infect ，2012，18（11）：1117-1125.

編輯/成森