益氣化瘀法對大鼠肛周膿腫術后創面組織中VEGF表達的影響

秦曉靜 丁博文 劉學 蔡亮亮

摘要：目的 觀察益氣化瘀法對大鼠肛周膿腫術后創面愈合過程中VEGF表達的影響，進一步探討益氣化瘀法促進創面愈合的作用機制。方法 將 30只SD大鼠完全隨機分為模型組（10只）、對照組（10只）、治療組（10）只，于術后第7 d，取創面全層組織，通過免疫組化檢測創面組織中 VEGF含量表達水平和血管數，并觀察創面愈合時間。結果 治療組大鼠創面組織中 VEGF含量表達水平顯著增加，與對照組、模型組比較，差異有統計學意義（P<0.001）。治療組創面愈合時間明顯優于模型組和對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 益氣化瘀法明顯促進實驗大鼠肛周膿腫術后創面的愈合，通過上調VEGF表達，促進血管的新生，加速創面的愈合。

關鍵詞：血管內皮生長因子；益氣化瘀；創面修復；肛周膿腫

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2016）06-0068-03

【Abstract】Objective： To observe the effect of Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method on VEGF expression in postoperative wound tissue of rat perianal abscess and further explore its mechanism to promote wound healing. Methods： 30 SD rats were randomly divided into a model group（10）and a control group（10）and a treatment group（10）. In the seventh day after surgery，the wound full tissue of the rats was taken and VEGF content expression and number of blood vessels in the wound tissue were detected by immunohistochemistry and wound healing time was observed. Results： VEGF expression level in the wound tissue of the treatment group significantly increased. Compared with the control group and the model group，the difference was statistically significant （P<0.001）. The healing time of the treatment group was quicker than that of the model group and the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion： Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method significantly promotes the postoperative wound healing of the rat perianal abscess and also promotes the rebirth of vascular and accelerates wound healing by upregulating the expression of VEGF.

【Key words】vascular endothelial growth factor，Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method，wound healing，perianal abscess

肛周膿腫是肛腸科常見疾病，手術為主要治療手段[1～2]，但術后由于特殊的解剖結構，加之糞便污染、炎癥刺激等因素，創面的修復一直是研究的熱點問題。中醫益氣化瘀法對慢性難愈性創面的修復有著較好的臨床療效。本研究旨在觀察根據益氣化瘀法自制生肌扶正油紗對實驗大鼠肛周膿腫術后感染創面的促愈作用，并通過觀察血管內皮生長因子（vascular factor，VEGF）在大鼠肛周膿腫術后創面愈合過程中的表達變化，進一步探討與闡明益氣化瘀法在創面愈合過程中的作用與機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 石蠟（上海國藥集團69018961）、甲醛（上海國藥集團10010018）、二甲苯（上海國藥集團10023418）、無水乙醇（上海國藥集團10092680）、30%H2O2（上海國藥集團10011218）、快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州邁新生物技術有限公司KIT-5020）、DAB濃縮型試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司DA1010）、蘇木素（BASO714094）、中性樹脂（上海長島生物技術有限公司G8590）、10%水合氯醛。

1.1.2 主要儀器及耗材 正置顯微鏡（OLYMPUS公司 CX41）、移液器（吉爾森P型移液器公司P2、P10、P20、P100、P200、P1000）、恒溫烘箱（上海恒一科學儀器有限公司DHG-9023A）、石蠟切片機（徠克公司SQ2125）、攤片機（徠克公司PPTHK-21B）、IMS圖象分析系統（上海哈靈生物科技有限公司）、數碼相機（NIKON公司D5100）。

1.1.3 藥物組成及制備 扶正生肌油紗條的制作方法：處方：黃芪500 g，黨參500 g，當歸500 g，乳香500 g，沒藥500 g，玄胡索300 g，黃柏300 g，珍珠300 g，冰片80 g；制法：以上九味分別粉碎成細粉，過篩，加食用植物油6000 g，浸漬5～7天，炸枯，去渣，濾過，煉至滴水成珠；將無菌紗布剪成2cm×3cm大小的紗條置于鋁制容器內；將煉好的藥液與適量的凡士林加熱混勻后倒入上述容器內；然后進行高溫高壓消毒后即可使用。

1.2 實驗動物與實驗方法

1.2.1 實驗動物及分組 動物來源清潔級SD（sprague-dawly）大鼠，雄性，體重250 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供（批號：醫動字第02-22-2號）。

1.2.2 動物模型 參照付小兵[3]及鄭雪平等[4]制造污染創面愈合的動物模型方法，加以改進后，擬造肛周膿腫術后創面的動物模型。大鼠背部手術區域備皮，以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，碘伏常規消毒，剪去直徑2.0 cm大小皮膚，破壞皮膚全層及皮下淺筋膜直至肌層，止血后在創面上滴加大腸埃希菌標準菌株（ATCC25922，由南京便診生物科技有限公司提供）0.1mL（1麥氏單位）。七號絲線縫合創面，48 h后拆除縫線，見傷口有膿性分泌物者為造模成功，即造成類似于臨床肛周膿腫術后的創面。以后每次治療前30 min在創面上滴加大腸埃希菌0.1 mL。

1.2.3 隨機分組 將造模后的30只大鼠，隨機分為模型組、對照組和治療組，每組各10只。

1.2.4 治療方法 于術后第l天開始治療，每天1次。治療組：大鼠創面清潔消毒后，扶正生肌油紗覆蓋創面；對照組：大鼠創面清潔消毒后，凡士林油紗覆蓋創面；模型組：大鼠創面清潔消毒后不作任何其他處理。

1.2.5 標本采集 大鼠造模成功，采用不同方法的治療后，于術后第7天時，腹腔注射麻醉后，于創面中心取約0.5 cm的肉芽組織，10%甲醛溶液固定標本。

1.2.6 檢測指標及檢測方法

1.2.6.1 創面愈合時間 觀察30只大鼠從創面用藥起到創面完全上皮化所需時間。

1.2.6.2 免疫組織化學法檢測VEGF表達 將采集固定好的標本，于甲醛溶液中固定24h后脫水，石蠟包埋，切片。然后進行烤片和脫蠟、水化、抗原修復、阻斷系列處理；一抗孵育：滴加一抗（選擇最佳稀釋比例），濕盒孵育，室溫下放置1 h（或者4℃孵育過夜）。0.02M PBS沖洗3 min×3次。二抗孵育：滴加HRP標記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min～30 min。0.02M PBS沖洗3 min×3次。顯色：DAB染色，觀察到切片有顏色改變時，立即用自來水洗去染色液。蘇木素染色：蘇木素復染3 min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度。自來水沖洗10 min，放入65℃烘箱中烘干水分。透明和封片：將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹膠封片，放入65℃烘箱中15 min。通過顯微鏡拍照，采集分析樣本相關部位，計算陽性面積。

1.2.6.3 圖像分析法分析微血管數 每張石蠟切片，隨機選取肉芽數組織區域的2個視野，計數每個視野的新生微血管（有完整管腔）。

1.3 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件進行處理，所有的結果均以（x±s）表示組間比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 創面愈合時間 見表1。

3 討論

肛周膿腫術后創面的愈合一直是肛腸科醫生致力解決的關鍵問題。術后換藥技術與局部創面的愈合時間及肛門功能恢復程度密切相關，決定著其最終治愈的效果。中醫學認為人是一整體，局部潰瘍愈合，關系全身氣血的運行。《醫林改錯》曰：“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”氣為血帥，正氣虛損則無力推動血行，血行不暢，瘀血內生，瘀血不去，新血不生，正氣無由恢復，則正氣耗損亦劇。兩者互為因果，形成惡性循環，導致創面難愈。故以益氣化瘀之法，使得正氣充沛，瘀血化除，氣行則血行，經脈流暢，創面生長迅速。實驗研究發現，益氣化瘀之法能有效促進創面愈合。益氣類中藥能夠影響創面的肉芽生長狀態及創面微血管的密度，改善二者的關系，促進創而的愈合，從而印證了“補虛生肌”、“化瘀生肌”的學術理論[5]。張平等研究發現活血化瘀、去腐生肌中藥能在創面愈合的炎癥和肉芽組織形成期促進bFGF和Hyp的生成，而在重組期減少其生成。這樣既能加速創面愈合，又能減少疤痕產生[6]。

創面愈合是一個動態的、復雜的過程，受多種因素的影響。一旦表皮和真皮的保護屏障被打破，傷口愈合的生理過程就立即進行。創面愈合涉及不同的凝血、炎癥、增生和組織重塑的重疊階段。肉芽組織形成是創面修復愈合的關鍵步驟之一，而肉芽組織的本質是大量的毛細血管和豐富的成纖維細胞。豐富的新生毛細血管數量和形態，能充實肉芽組織且改善創面微循環，為組織修復提供所必須的氧及豐富的營養物質，從而有利于創面愈合。在創傷愈合中血管的形成是至關重要的一步，血管形成傷口愈合和組織再生的重要環節，VEGF是血管內皮細胞的有絲分裂原，是血管形成的關鍵調控因素之一[7]，它能特異性地作用于血管內皮細胞，具有維持血管正常形態和完整性、提高血管通透性、促進血管生成等作用[8]，在創面愈合過程中發揮重要作用。

本科在益氣化瘀法的指導下，自制了生肌扶正油紗，在長期的臨床實踐中印證了該油紗在肛周膿腫術后換藥中，能明顯促進創面的愈合，但缺乏有效的科學實驗來闡明其作用機理。本實驗通過實驗大鼠模擬肛周膿腫術后感染創面，發現創面愈合時間明顯縮短，觀測VEGF在創面肉芽組織中的表達，結果顯示扶正生肌油紗組陽性面積表達顯著升高，血管數亦高于對照組和模型組，因此反應了益氣化瘀中藥能通過上調創面組織VEGF表達量，誘導血管新生，在一定程度上改善創面組織的缺血、缺氧狀態，從而促進創面愈合。

本研究為臨床上應用益氣化瘀法中藥治療感染性難愈性創面提供了科學的實驗依據。

參考文獻：

[1]H.A.Formijne Jonkers，W.A.Draaisma，S.D.Wexner，et al.Evaluation and surgical treatment of rectal prolapse：an international survey，Colorectal Dis，2013（15）：115-119.

[2]L.Bordeianou，C.W.Hicks，A.M.Kaiser，et al.Rectal prolapse：an overview of clinical features，diagnosis，and patient-specific management strategies，J Gastrointest Surg，2014（18）：1059-1069.

[3]付小兵，孫同柱，盛志勇.幾種用于創傷修復研究的動物模型[J].中華實驗外科雜志，1999，16（5）：479-480.

[4]鄭雪平，許慧琴，丁義江，等.復方珠黃霜對兔背部人糞污染創面愈合的實驗研究[J].中國中西醫結合外科雜志，2002，8（5）：361-364.

[5]張臻，閥華發.益氣化瘀法中藥對糖尿病大鼠肉芽增生期創TGF-β/ALK5/Smad2/3通路的影響[J].新中醫，2015，47（6）：270-272.

[6]陳平，張自強，施展，等.生肌玉紅膏促進大鼠背部創面愈合的實驗研究[J].云南中醫藥雜志，2010，31（5）：58-59.

[7]Kwon MJ，An S，Choi S，et al.Effective healing of diabetic skin wounds by using nonviral gene therapy based on minicir-cle vascular endothelial growth factor DNA and a cationic den-drimer[J].J.Gene Med，2012，14（4）：272-278.

[8]王佳琪，王國棟，顏紅柱，等.生長因子在創傷愈合中作用的研究[J].創傷外科雜志，2013，15（3）：281-283.

（收稿日期：2016-03-28）