青島地區鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定

遲夢宇 錢恒偉 趙穎 黃金光

摘要：2015年鵝掌柴炭疽病在青島地區發病嚴重，發病率達50%。本研究從青島城陽區采集鵝掌柴炭疽病病葉，采用組織分離法對病原菌進行分離，結合形態學觀察與分子生物學方法對其進行鑒定。結果表明，引起青島地區鵝掌柴炭疽病的病原菌是膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.）。此病原菌引起的鵝掌柴炭疽病在山東省是首次報道。

關鍵詞：鵝掌柴炭疽病菌；膠孢炭疽菌；形態特征；分子鑒定

中圖分類號：S436.8+1文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）06-0092-03

鵝掌柴（Schefflera actinophylla [Endl.] Harms）俗名大葉傘，隸屬五加科，鵝掌柴屬，是一種深受人們喜愛的常綠觀葉木本花卉植物，可用于花園、花壇、道路綠化或者作為盆栽置于庭院和室內觀賞。鵝掌柴原產于大洋洲、我國廣東、福建等亞熱帶雨林，日本、越南、印度也有分布，現廣泛種植于世界各地。但是，鵝掌柴在繁殖和栽培種植時常會發生病害，大大影響其觀賞價值。對鵝掌柴的病原真菌，美國記載了15種[1]。在我國，2003年，習平根等[2]調查鑒定了廣東省鵝掌柴12種真菌病害及其病原菌，其中以葉疫病和炭疽病危害較重。2012年，黃江華等[3]對廣東省鵝掌柴炭疽病病原菌進行鑒定。2015年，鵝掌柴炭疽病在青島地區發病嚴重，發病率高達50%。為有效防控鵝掌柴炭疽病，筆者用病原形態學及分子生物學方法研究青島市鵝掌柴炭疽病病原菌，為該病的綜合治理提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1供試材料2015年11月采集青島城陽地區的鵝掌柴炭疽病病葉，并對其進行分離純化。

1.1.2試劑馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL；75%乙醇（化學純）；0.1%升汞溶液；無菌水。

1.2試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化與培養采用組織分離法對鵝掌柴病葉上的病原菌進行分離。于病健交界處切取病組織長度為4～5 mm的小塊，置于75%乙醇中浸泡5 s，接著移入0.1%升汞溶液中浸泡3～5 min，無菌水漂洗3遍，最后將病組織移到PDA培養基上，置于25℃培養箱中培養3～7 d[4]。

從邊緣挑取病原菌菌絲于PDA培養基上，25℃培養箱中進行純培養，4 d后挑取純培養菌絲至斜面保存。

1.2.2致病性接種及再分離挑取3片健康鵝掌柴葉片，用無菌水清洗葉片表面并用酒精消毒。用滅菌針將葉片刺傷，再接種病原菌塊，將接好菌的葉片放在盛有濕潤濾紙的培養皿中，25℃培養7 d后觀察發病情況，以無菌PDA接種作為陰性對照。從接種的發病組織上再次分離純化病原菌。

1.2.3病原菌形態觀察用1 mL無菌水反復沖洗PDA上的分生孢子以獲得濃度為104個/mL的孢子懸浮液，用滅菌接種針挑取少量菌絲置于滅菌載玻片上，用挑針挑取培養基內部的菌核放在滴有無菌水的載玻片上，在Olympus BX53顯微鏡下觀察病原菌的菌核、菌絲、分生孢子梗和分生孢子特征并拍攝形態圖，測量分生孢子大小。

1.2.4病原菌rDNA-ITS序列測定采用CTAB法提取病原菌基因組DNA[5]，用真菌通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增[6]（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。PCR反應體系為25 μL，反應液為：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，引物（ITS1和ITS4）各1 μL，Taq酶0.5 μL，DNA模板3 μL，ddH2O 16 μL。PCR擴增程序：94℃預變性 5 min ；94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，進行30個循環；72℃總延伸 10 min。在質量濃度為1%的瓊脂糖凝膠上檢測PCR結果，產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，并進行BLAST同源性對比。

2結果與分析

2.1鵝掌柴炭疽病癥狀

發病初期，病斑從枝干中間向上向下發展，沿著葉脈侵染葉片，病斑近橢圓形，灰白色，形狀規則至不規則形。在環境陰濕的情況下病斑不斷擴展成水澤狀墨綠色病塊，發病嚴重的植株整條枝干和葉片均成墨綠色，枝干橫切后內部也都變成墨綠色至黑褐色。后期病斑上可見黑色小點，為病原菌的分生孢子盤，濕度大時病部可產生大量的粉紅色粘孢團（圖1）。

2.2病原菌形態觀察

在PDA培養基上，鵝掌柴炭疽病病原菌菌落白色至灰白色，邊緣整齊，氣生菌絲發達，后期產生菌核可長至培養基內。病原菌分生孢子梗無色，具隔膜；分生孢子無色，單孢，長橢圓形至圓柱形，較直，大小為（13.3～18.4） μm×（3.8～5.6）μm（圖2）。根據形態結果初步判定病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2.3rDNA-ITS序列分析

應用真菌18S～28S rDNA間隔區序列的通用引物ITS1和ITS4，從病原菌基因組DNA中PCR擴增到一條約500 bp的片段（圖3）。測序結果表明，該片段長547 bp（登錄號：KU820630），將其在GenBank中進行同源比較分析，BLAST比對結果表明，該菌株的rDNA-ITS序列與已報道的C. gloeosporioides菌株（KT582155、KT582183）的序列相似性為99%。分子鑒定進一步證實該病原菌為Colletotrichum gloeosporioides。

3討論與結論

鵝掌柴炭疽病是危害鵝掌柴的主要病害之一，在美國、中國廣東省都有過報道。近年來，隨著國內外花卉貿易的發展，青島市從廣東、云南等省市引種大量鵝掌柴。鵝掌柴炭疽病在青島地區發病也日漸嚴重，影響了鵝掌柴的觀賞價值，嚴重的引起植株死亡，造成較大經濟損失。為有效防控鵝掌柴炭疽病，本研究對其病原菌進行了形態學和分子生物學鑒定，證實青島鵝掌柴炭疽病病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），對該地區鵝掌柴炭疽病的防治具有重要意義。該病原菌是炭疽屬內最大的一個種群，其分布非常廣泛，在海南、臺灣、廣東、廣西、湖北、福建、山東等地均有分布，危害寄主近300種，可引起芒果、香蕉、葡萄、龍眼、萬年青、七葉樹等多種植物的炭疽病。炭疽病菌在潮濕環境下發病重，所以在福建、廣東、海南等地區鵝掌柴炭疽病發病較重。

參考文獻：

[1]Farr D F， Bills G F， Chamuris G P， et al. Fungi on plants and plant products in the United States[M]. Minnesota： APS Press， 1989：44.

[2]習平根，戚佩坤，姜子德. 鵝掌柴真菌病害鑒定[J]. 植物病理學報， 2003， 33（1）： 19-24.

[3]黃江華，葉宜麗. 鵝掌柴炭疽病病原菌鑒定[J]. 廣東農業科學，2012（16）： 69.

[4]代麗婷，劉東，張艷菊.黑龍江省冬小麥雪腐病病原鑒定及生物學特性研究[J].植物保護，2013，39（1）：44-49.

[5]劉少華，陸金萍，朱瑞良，等.一種快速簡便的植物病原真菌基因組DNA提取方法[J].植物病理學報，2005，35（4）：362-365.

[6]郭鵬豪，劉秀麗，崔穎鵬，等.真菌通用引物Its1和Its4在絲狀真菌鑒定中的價值評價[J].中國微生態學雜志， 2013，25（8）：922-924.