構建原代分離培養與鑒定小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的方法及模型

張秋墨 金丹

【摘要】目的：構建能夠對小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞進行分離、原代培養與鑒定的方法，從而對建立穩定高效的細胞膜性起到積極的促進作用。方法：（1）使用低濃度胰酶聯合Ⅰ型膠原酶消化法，對小鼠的肺泡Ⅱ型上皮細胞進行分離；（2）經差速離心差速貼壁和免疫黏附法對Ⅱ型上皮細胞進行純化及原代培養。并倒置顯微鏡對細胞形態及生長狀況進行觀察，測定肺泡Ⅱ型上皮細胞的產量、活力以及純度。對肺泡表面活性蛋白A和C的表達進行免疫細胞化學染色鑒定，使用透射電鏡對肺泡Ⅱ型上皮細胞的特異性細胞結構進行鑒定。結果：每只小鼠所獲得的肺泡Ⅱ型上皮細胞數量為 ，純度為 ，細胞活力為 。且原代肺泡Ⅱ型上皮細胞在對倒置顯微鏡下為立方形或圓形，細胞質內存在許多差別非常明顯的細小顆粒，生長方式為島狀；在免疫細胞化學鑒定方面，肺泡表面的活性蛋白A為棕黃色，C為綠色，二者都定位表達于細胞漿；透射電鏡可見特征性板層小體及細胞游離面大量微絨毛。結論：胰酶聯合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產量和純度都具有優勢的AECⅡ，符合一般的體外實驗的要求。

【關鍵詞】原代分離；小鼠；肺泡Ⅱ型上皮細胞；方法；模型

1材料和方法

1.1材料

設計：單一樣本觀察。

地點：XX大學中心實驗室。

材料：健康清潔的小鼠6只，雌雄均為3只，體重19～23g。在實驗中對動物的處置符合國家《關于善待動物的指導性意見》中的相關規定。

試劑及儀器主要包括DEME培養基、 青霉素、 鏈霉素、Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶等等以及兔抗鼠SP-A-抗、SP-C-抗、多聚賴氨酸、SABC試劑盒、DAB試劑盒、高速臺式離心機、 培養箱以及倒置顯微鏡和透射電鏡等等。

1.2方法

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞分離：將小鼠脫頸處死，盡快取下肺組織并洗干凈；將其剪成小塊；放入10mL的離心管，以2mL/只小鼠的標準加入1g/L胰蛋白酶。將吸管吹打均勻后在37℃的溫度孵育5min，將消化好的細胞懸液移除，并加入與之等量的含10%胎牛血清的DEME中止消化；使用同法用1g/L胰蛋白酶對肺組織進行5mim的消化，將消化好的細胞懸液移除并中止消化；在剩余肺組織中，按上述標準加入Ⅰ型膠原酶，孵育15min，移除細胞懸液，加入同上的胎牛血清，中止消化；吸管混勻后用過濾、離心、去上清，用DEME重懸沉淀。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞純化與培養：將肺細胞懸液接種入包被小鼠1gG的培養皿中，并孵育，吸出含未黏附細胞的液體接種于另一包被小鼠的1gG培養皿中，同法繼續孵育2次，并使用胎牛血清重懸沉淀，并接種于培養皿和培養板中，24h后換液，此時貼壁的即為Ⅱ型上皮細胞。

小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的鑒定：將其置于6孔培養板內，并使用多聚賴氨酸浸泡，吸出多聚賴氨酸后徹底吹干。對純化后的肺細胞懸液濃度進行調整并接種于蓋玻片，并加入SP-A-抗及SP-C-抗，進行免疫細胞化學操作，然后置于倒置顯微鏡下觀察。

2結果

在AECⅡ的產量、純度及活力方面，每只小鼠的平均值分別為 、 、 。

倒置顯微鏡下，免疫黏附純化后的AECⅡ在接種后的12～18h開始伸展貼壁，形狀為圓形活力放心，且有小顆粒，胞核明顯。24h后逐漸融合。48h之內為多邊形，72h后顆粒減少。六七天后無法辨認Ⅱ型細胞形態。而免疫黏附細胞48h后大量纖維細胞貼壁生長，呈不規則三角形或梭形。

透射電鏡下，小鼠AECⅡ呈圓形或立方形，胞質內有小泡，細胞游離面見大量微絨毛。其中圖1為倒置顯微鏡下原代培養的小鼠AECⅡ。

3討論

就目前的技術來說，從肺組織中將AECⅡ分離出來最常用的方法是酶消化法。常用的消化酶有胰蛋白酶、彈性蛋白酶和膠原酶等。本次研究中使用的是胰蛋白酶聯合Ⅰ型膠原酶的方式，而且降低了胰蛋白酶的消化濃度和時間。使用這種方式的目的，一是為了降低胰蛋白酶對肺泡上皮細胞的損傷，二是為了保證AECⅡ獲取的數量。膠原酶能夠對細胞基質起到消化作用，但對上皮細胞的影響不大。在細胞分離的過程當中，因為酶會對細胞產生一定的損害，細胞釋放出DNA，并與細胞外基質形成DNA蛋白復合物，從而將細胞聚集起來。因此，為了使細胞無法聚集成團，經常使用脫氧核糖核酸酶進行控制。在本次研究中，整個分離過程也都存在脫氧核糖核酸。而且，提高細胞活性的條件還包括保持低溫、縮短細胞分離的時間。

肺組織中的細胞較多，經過酶消化后得到的細胞懸液中包括AECⅡ、纖維細胞、淋巴細胞等等。這樣的AECⅡ是不符合實驗研究的需要的，必須對其進行純化。AECⅡ純化方法種類較多，例如免疫黏附選擇、密度梯度離心法、單克隆抗體技術、貼壁選擇以及流式細胞儀篩選等等。每種方式均有自身的優缺點，但部分方法的操作過程較為復雜，而且結果并不是很理想，細胞的數量較少，也容易受損。而使用差速離心差速貼壁和免疫黏附法對其進行純化，所得到的產量、純度、活力等均較高。本次研究中分別達到了 、 、 。

AECⅡ的鑒定主要是通過自身的形態及特異性來實現對標志物的表達。AECⅡ特異表達的物質較多，例如SP-A、SP-B、SP-C等等。完全分化的AECⅡ最具代表性的表型是表達表面活性蛋白。在AECⅡ中，SP-A的含量最多，特異性及敏感性較高，檢出比較容易，因此是對免疫細胞進行化學鑒定的一種新方式。而SP-C是僅在AECⅡ上表達的唯一活性蛋白，因此也可使用它來進行AECⅡ的鑒定。在本次研究中，同時使用了SP-A和SP-C進行鑒定，相互之間取長補短，使得鑒定結果的可靠性增加，而且在20h就能完成，使得鑒定時間縮短。

結束語：

綜上所述，胰酶聯合膠原酶消化，差速離心差速貼壁和免疫黏附純化法能夠獲得產量和純度都具有優勢的AECⅡ，符合一般的體外實驗的要求。

【參考文獻】

[1]陳坤，鄧世雄，劉芳君等.小鼠胎鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離、原代培養及鑒定[J].西南大學學報：自然科學版，2011，12（12）：123-126

[2]王燕，Aron B.Fisher，宋善路等.抗氧化酶Prdx6保護肺泡Ⅱ型上皮細胞抵抗過氧化氫誘導細胞凋亡的作用[J].實用兒科臨床雜志，2012，06（16） ：82-84.