耕種模式對三江平原黑土細菌多樣性的影響

汪城墻 黃嶠璟 呂剛 胡文豪 朱瑞敏 丁延芹 杜秉海

摘要：本試驗使用Illumina MiSeq測序平臺，選取我國東北三江平原地區的大田黑土、菜園黑土和森林黑土3種樣本，對不同耕種黑土表層細菌群落結構進行分析。結果顯示：大田土、菜園土和森林土的微生物群落存在明顯差異。大田土的群落豐富度明顯低于菜園土和森林土，后兩者相似度較高。大田土的OTU數比菜園土和森林土分別少13.3%和7.6%。菜園土的微生物群落組成種類最為豐富，森林土中硝化螺旋菌門含量最高，大田土微生物群落含有的外源性物質降解相關基因相對豐度較高。可見，三江平原大田黑土的退化和土壤微生物群落的改變有關，調節土壤微生物群落結構將有助于東北大田黑土的修復。

關鍵詞：細菌群落多樣性；高通量測序；黑土地；耕種模式

中圖分類號：S154.36文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0076-06

我國東北地區的黑土為世界上四大黑土地之一，是我國主要土壤類型之一，其土質肥沃、質地疏松，是重要的商品糧生產基地[1，2]，總面積達1.0×107 hm2[3]，由黑龍江、松花江和烏蘇里江沖積而成的三江平原是其中的重要組成部分。但由于我國長期實行的農業耕作方式產生的一些弊端，尤其是長期單獨施用化肥，致使黑土肥力顯著下降，出現土壤板結、酸化、可耕性變差等土壤退化問題[4，5]，亟待解決。

土壤含有大量的微生物，包括細菌、放線菌、真菌、原生動物和顯微藻類等，其中細菌含量最高[6]，在黑土土壤中約占微生物總數的80%以上[7]。土壤微生物群落是土壤生態系統的重要組成部分，在土壤有機物質轉化和養分循環等多種生態過程中起著積極作用[8]。土壤微生物群落對生存環境的變化十分敏感，可以隨著環境變化做出響應[9]，是衡量土壤生物學活性以及生產力的一項重要指標[3]。土壤微生物群落多樣性即為土壤微生物活性指標中最重要的因素[10]，在一定程度上反映土壤性能。有研究表明，長期不同的人為施肥制度對土壤的微生物數量和群落結構影響顯著[11]，如：長期施入氮肥會降低土壤微生物活性；而植物殘體和糞肥等有機肥料的施入可維持土壤肥力及微生物系統穩定，進而可改善土壤微生態環境或提高土壤微生物群落功能多樣性[4，12，13]。對黑土土壤微生物群落功能多樣性進行研究，可分析出微生物群落的功能，找出土壤肥力和土壤微生物之間的關系，對黑土土壤肥力及健康評價具有重要意義[2]，也可對退化黑土土壤進行有效的微生物修復提供重要參考。近年來，對土壤微生物的群落結構與組成的研究備受關注。

本試驗研究了長期施用化肥并種植經濟作物的大田表層黑土、長期施用農家肥并種植蔬菜的菜園表層黑土以及森林表層黑土的細菌群落多樣性，分析長期不同耕種方式及人為干擾對三江平原黑土地表層細菌群落多樣性的影響，為三江平原大田黑土的微生物修復策略找到合適的微生物菌群、實現土地可持續利用提供科學依據。

1材料與方法

1.1取樣

取樣地點分布在黑龍江省鶴崗市蘿北縣軍川農場（隸屬北大荒集團），地處三江平原，介于東經131°02′～131°30′、北緯47°20′～47°40′之間。選取樣本分為三類：森林土、菜園土以及大田土，分別編號為Ne1、Ne3和Ne4。森林土為東北寒溫帶原始森林地表層以下10～15 cm的黑土，菜園土為20世紀70年代開墾以來長期混種多種蔬菜和不定期施用不同種類農家肥的地表層以下10～15 cm的黑土，大田土為開墾以來長期種植大豆和玉米兩種作物并施用化肥的地表層以下10～15 cm的黑土。取樣時間為2015年8月1日。土壤取出后立即于-20℃凍存，一個月內完成分析工作。

1.2樣品處理

每種樣本選擇兩個生物學重復，用美國OMEGA公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取土壤總DNA，檢測合格后，采用Illumina MiSeq測序平臺，委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行土壤細菌多樣性檢測。

2結果與分析

2.1樣本測序數量的可信度

本試驗中測序分析選擇的測序數量為40 000條左右，從圖1稀釋曲線可以看出，所選測序斜率明顯變小，說明測定的各樣本能夠反映真實物種的豐富度，數據分析和處理合理、可信度高。

2.2Alpha多樣性分析

一個特定區域或生態系統內的微生物多樣性常用Alpha 多樣性來表示，可反映出豐富度和均勻度的綜合指標。群落豐富度的指數Chao指數和ACE指數均和樣本群落豐富度呈正比。群落多樣性的指數Shannon指數和Simpson指數，分別和群落多樣性呈正比和反比。三種樣本在97%相似水平上的Alpha 多樣性分析結果見表1。樣本Ne3的Chao 指數和 ACE 指數最大，說明樣本中含有的OTU數多，即群落豐富度最高；其次是Ne1，最小的是Ne4。不同樣本的Simpson指數差別不大，Shannon指數具有Ne3、Ne4、Ne1依次減小的趨勢，群落多樣性逐漸降低。

2.3Beta多樣性分析

Beta 多樣性是不同生態系統之間的多樣性比較，可反映樣本間是否具有顯著的微生物群落差異。本試驗使用Qiime軟件對三組樣本之間物種的進化以及豐度信息進行 Unifrac分析[14]，得到樣本間差異的距離矩陣，然后對樣本之間的距離矩陣信息進行 PCoA 分析和 NMDS 分析，對PCoA分析的結果繪制出3D 圖（圖2A），對 NMDS 分析的結果利用 R 軟件繪制出NMDS 圖（圖2B）。圖中的每個點代表一個樣本，顏色相同的點屬于同一種分組，三樣本組的兩個生物學重復之間的距離較近，三種樣本間的距離相對較遠，說明三種樣本間的微生物群落存在差異。

2.4樣本群落組成分析

根據測序得到的 OTU結果，可以得到各種樣本在各分類水平上，即門、綱、目、科、屬上的物種組成比例情況，反映樣本在不同分類學水平上的群落組成結構。Ne1、Ne3和Ne4三種樣本中檢測到的細菌門數分別為38、40、39；細菌綱數分別為115、119、109；細菌目數分別為166、168、161；細菌科數分別為200、213、202；細菌屬數分別為241、270、257；細菌種數分別為78、87、81。在各分類水平上，Ne3都表現出最多的數量；在綱、目水平上，Ne1比Ne4表現出一定數量優勢；在科、屬和種水平上，Ne4比Ne1表現出數量優勢。

由圖3可以看出，在Ne1、Ne3和Ne4三組樣本中，變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）含量最多，分別占到60.5%、63.75%、66.39%。疣微菌門（Verrucomicrobia）在Ne1、Ne3和Ne4中差異顯著，含量分別為10.02%、3.33%和3.08%。酸桿菌門（Acidobacteria）含量差別也較大，在Ne1、Ne3和Ne4中的含量分別為6.33%、7.68%和4.92%。綠彎菌門（Chloroflexi）和浮霉菌門（Planctomycetes）在三個樣本Ne1、Ne3和Ne4中含量具有逐漸增多趨勢。Ne1中的硝化螺旋菌門（Nitrospirae）含量為0.75%，明顯高于Ne3和Ne4中的0.35%和0.17%；Ne1中的熱袍菌門（Thermotogae）也明顯高于Ne3和Ne4；而厚壁菌門（Firmicutes）的含量只為Ne3和Ne4的約一半。Ne3中綠菌門（Chlorobi）含量明顯低于Ne1和Ne4，而衣原體門（Chlamydiae）和梭桿菌門（Fusobacteria）的含量明顯高于Ne1和Ne4，芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）的含量也略高于Ne1和Ne4。Ne4中螺旋體門（Spirochaetes）較高于Ne1和Ne3。另外，在Ne1中未檢測到纖維桿菌門（Fibrobacteres）和互養菌門（Synergistetes），在Ne4中未檢測到脫鐵桿菌門（Deferribacteres），總體上來看，菜園土Ne3中的細菌門水平上種類最為豐富。

2.5樣本間的OTU 聚類分析

本試驗利用R軟件在97%的相似水平上對樣本Ne1、Ne3和Ne4序列進行 OTU 的聚類分析，生成樣本間OTU 的維恩圖，分析菌種數目[10]，結果見圖4。樣本Ne1、Ne3和Ne4中的OTU數分別為4 498、4 791和4 156。Ne4的OTU數比Ne1和Ne3分別減少7.6%和13.3%，Ne3的比Ne1高6.5%。樣本Ne1、Ne3和Ne4共有的OTU數為2 351。樣本Ne1、Ne3和Ne4特有的OTU數分別為754、872和568。Ne4和Ne3共有OTU數為3 057，和Ne1共有2 882。Ne1和Ne3共有OTU數為3 213，明顯高于兩樣本和Ne4的共有數量。

應用軟件R將三組樣本屬水平上的分類信息進行聚類，繪制 heatmap 熱圖，見圖5。熱圖 heatmap用顏色變化直觀地將數據值大小表示出來，將高豐度和低豐度的物種分塊聚集，反映三樣品在屬水平上群落組成的相似性和差異性。結果顯示，相比于人類耕種的樣本Ne3和Ne4，天然樣本Ne1的甲基桿菌屬（Methylobacterium）、特呂珀菌屬（Truepera）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、Azohydromonas和黃桿菌屬（Flavobacterium）的物種豐度較高。相比于大田樣本Ne4，樣本Ne1和Ne3的新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）、特呂珀菌屬（Truepera）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、拉氏桿菌屬（Rathayibacter）、Azohydromonas和黃桿菌屬（Flavobacterium）豐度較高。相比于Ne1和Ne4，菜園土樣本Ne3的Kaistobacter、出芽菌屬（Gemmata）、農桿菌屬（Agrobacterium）、豐佑菌屬（Opitutus）、氣微菌屬（Aeromicrobium）、紅游動菌屬（Rhodoplanes）豐度較高。不同樣本之間細菌屬的類別存在較大差異。大田土Ne4與菜園土Ne3、森林土Ne1的相似度較低，而菜園土Ne3和森林土Ne1的相似度較高。

2.6群落功能基因預測

基于宏基因組的物種豐度信息以及物種的基因組數據庫信息，預測三樣品群落的功能基因組成。根據OTU水平的豐度信息，利用軟件PICRUSt[15]進行功能基因的預測和相關統計分析，更加深入地了解樣本的微生物群落并可比較樣本在功能基因方面的差異，結果見圖6。

轉錄相關基因、折疊分揀以及講解相關基因、質代謝相關基因、多糖生物合成和代謝相關基因有由樣本Ne1、Ne3和Ne4相對豐度逐漸減少的趨勢。外源性物質降解和代謝相關基因、氨基酸代謝相關基因有由樣本Ne1、Ne3和Ne4相對豐度逐漸增加的趨勢。Ne3樣本中，細胞運動性相關基因、復制和修復相關基因相對豐度較高，膜運輸基因較少。

3討論與結論

我國大田耕作中，大量施用化肥以及長期耕種，造成東北黑土壤的活力退化，也勢必改變其中的微生物群落多樣性。通過對比原始森林黑土以及良性耕作的菜園黑土的微生物群落，可以認識和了解長期大田耕作黑土微生物群落多樣性的改變，對后續的微生物修復具有積極的理論意義。

本試驗結果發現，所采集的三江平原大田黑土、菜園黑土和森林黑土三種樣本間的微生物群落存在明顯差異。大田土的群落豐富度明顯低于菜園土和森林土，后兩者相似度較高，菜園土的群落豐富度最高，與已報道的趨勢一致[13， 16]。通過OTU聚類分析顯示，大田土的OTU數比菜園土和森林土分別少13.3%和7.6%。從樣本微生物群落組成分析，大田土的微生物群落中，綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）和螺旋體門（Spirochaetes）含量較多，疣微菌門（Verrucomicrobia）、酸桿菌門（Acidobacteria）含量較少，未檢測到脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。森林土中硝化螺旋菌門（Nitrospirae）含量最高，分別約為菜園土和大田土的2倍和4倍，這可能有利于自然界中森林土的自身氮素循環，而大田土和菜園土可能受長期施加不同種類氮素肥料的影響?？傮w上來看，菜園土的微生物種類最為豐富，這可能跟其種植作物多樣性和施用的農家肥種類多樣性相關，其中，衣原體門（Chlamydiae）和梭桿菌門（Fusobacteria）的含量明顯高于森林土和大田土，這可能跟菜園土施加農家肥引入一些動物源豐富的微生物所致。群落功能基因預測結果也顯示出三種土樣一些功能基因的差異，其中，大田土的外源性物質降解相關基因相對豐度較高，這可能是由于長期耕種模式下，大田土中產生了一些外源性有害物質，刺激微生物群落中降解相應物質的微生物的含量增加。

東北黑土地因長期的農業耕作發生了變化，也造成了土壤微生物群落和功能的改變。良性的菜園耕種模式對東北黑土可以起到積極的效果，而長期施加化肥的大田耕作模式則起到負面效果。推測施用大田土差異顯著的微生物菌群肥料或菌劑，代替或部分代替化學肥料，調節土壤微生物群落結構，將有助于東北耕地黑土的微生物修復，進而提高糧食產量。

參考文獻：

[1]高崇升，王建國. 黑土農田土壤有機碳演變研究進展[J]. 中國生態農業學報，2011，19（6）： 1468-1474.

[2]魏巍，許艷麗，朱琳，等. 長期施肥對黑土農田土壤微生物群落的影響[J]. 土壤學報，2013，50（2）： 372-380.

[3]李東坡，武志杰，陳利軍，等. 長期培肥黑土微生物量磷動態變化及影響因素[J]. 應用生態學報，2004，15（10）： 1334-1338.

[4]Marschner P， Kandeler E， Marschner B. Structure and function of the soil microbial community in a long-term fertilizer experiment[J]. Soil Biology and Biochemistry， 2003， 35（3）： 453-461.

[5]王小兵，吳元元，鄧玲. 東北黑土區黑土退化防治與保護研究[J]. 資源與產業，2008，10（3）： 81-83.

[6]崔金香，王帥. 土壤微生物多樣性研究進展[J]. 河南農業科學，2010（6）： 165-169.

[7]王英，王爽，李偉群，等. 長期定位施肥對土壤微生物區系的影響[J]. 東北農業大學學報，2007，38（5）： 632-636.

[8]Srivastava S， Singh J，Microbial C. N and P in dry tropical forest soils： effects of alternate land-uses and nutrient flux[J]. Soil Biology and Biochemistry， 1991， 23（2）： 117-124.

[9]余悅. 黃河三角洲原生演替中土壤微生物多樣性及其與土壤理化性質關系[D]. 濟南：山東大學，2012.

[10]張忠民，劉虎，丁延芹，等. 多抗菌劑對植煙土壤細菌群落多樣性的影響[J]. 山東農業大學學報（自然科學版），2015（4）： 528-532.

[11]樊曉剛，金軻，李兆君，等. 不同施肥和耕作制度下土壤微生物多樣性研究進展[J]. 植物營養與肥料學報，2010，16（3）： 744-751.

[12]張志明，許艷麗，韓曉增，等. 連續施肥對農田黑土微生物功能多樣性的影響[J]. 生態學雜志，2012，31（3）： 647-651.

[13]劉晶鑫，遲鳳琴，許修宏，等. 長期施肥對農田黑土微生物群落功能多樣性的影響[J]. 應用生態學報，2015，26（10）： 3066-3072.

[14]Lozupone C， Knight R. UniFrac： a new phylogenetic method for comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2005， 71（12）： 8228-8235.

[15]Langille M G， Zaneveld J， Caporaso J G， et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences[J]. Nature Biotechnology， 2013， 31（9）： 814-821.

[16]孟慶杰，許艷麗，李春杰，等. 不同施肥/土地利用方式對黑土細菌多樣性的影響[J]. 大豆科學，2008，27（3）： 480-486.