HPLC法測(cè)定鹽酸苯海拉明乳膏的含量

白 林，范金釗，蔡 樂，徐風(fēng)華（.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 00853；.安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 33000）

HPLC法測(cè)定鹽酸苯海拉明乳膏的含量

白 林1，范金釗2，蔡 樂1，徐風(fēng)華1（1.解放軍總醫(yī)院藥品保障中心，北京 100853；2.安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

目的：建立測(cè)定鹽酸苯海拉明乳膏含量的方法。方法：采用HPLC法，色譜柱：Platisil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）；檢測(cè)波長：258 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：40 ℃。結(jié)果：鹽酸苯海拉明與其它雜質(zhì)峰分離良好。鹽酸苯海拉明在125.0 ～ 1 000.0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r = 1.000 0）；鹽酸苯海拉明的平均回收率為98.18%，RSD = 0.40%（n = 9）。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于鹽酸苯海拉明乳膏的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；鹽酸苯海拉明乳膏；含量測(cè)定

鹽酸苯海拉明乳膏收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[1]，具有抗過敏、止癢、消炎、消腫作用，臨床上常用于治療急性濕疹、皮炎及其他各種過敏性皮膚疾病。原含量測(cè)定方法為銀量法和陰離子表面活性劑雙向滴定法[1]，銀量法測(cè)定的是氯離子的含量，專屬性不強(qiáng)且突躍顏色不明顯；陰離子表面活性劑雙向滴定法中十二烷基硫酸鈉溶液是一種表面活性劑，表面張力低，易從滴定管下漏，不易控制消耗毫升數(shù)，該法采用二甲基黃-溶劑藍(lán)19混合指示液，滴定終點(diǎn)氯仿層由綠色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t灰色，顏色變化不明顯，突躍點(diǎn)不易觀察。兩種方法準(zhǔn)確度、靈敏度較低，本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[2-7]采用HPLC法，快速、準(zhǔn)確的測(cè)定了鹽酸苯海拉明乳膏的含量，以期為有效控制其制劑質(zhì)量提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元梯度泵、自動(dòng)脫氣機(jī)、VWD檢測(cè)器和化學(xué)工作站，美國安捷倫科技有限公司）；UV-2550型紫外分光光度儀（日本島津公司）。

鹽酸苯海拉明對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100066-200807）；乙腈為色譜純，冰醋酸、三乙胺為分析純。鹽酸苯海拉明乳膏（本院制劑室提供，規(guī)格：20 g，批號(hào)20131223、20131230、20131231）；二苯酮（美國ChemService公司，批號(hào)727800）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Platisil C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）用冰醋酸調(diào)至pH 6.5；檢測(cè)波長：258 nm；柱溫：40 ℃；流速：0.8mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液：取鹽酸苯海拉明對(duì)照品約0.250 0 g，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。取二苯酮對(duì)照品約0.014 8 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述儲(chǔ)備液各1 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液（含鹽酸苯海拉明500 μg·mL-1、二苯酮14.8 μg·mL-1）。

（2）供試品溶液：取鹽酸苯海拉明乳膏約1.25 g，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動(dòng)相30 mL，置于50 ℃水浴加熱振搖使溶解，放冷至室溫，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，置冰浴中冷藏1 h，取出，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

（3）陰性對(duì)照溶液：按處方比例取除鹽酸苯海拉明以外的其余成分，按鹽酸苯海拉明乳膏的制備工藝制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。見圖1。

圖1 鹽酸苯海拉明色譜圖A – 對(duì)照品，B – 供試品，C – 陰性對(duì)照；1 – 鹽酸苯海拉明，2 – 羥苯乙酯（防腐劑），3 – 二苯酮（苯海拉明分解產(chǎn)物）Fig 1 Chromatograms of diphenhydramine hydrochlorideA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – diphenhydramine hydrochloride, 2 – ethyl hydroxybenzoate (preservative), 3 – benzophenone (the decomposition product of diphenhydramine)

2.4 線性關(guān)系考察

吸取鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液，含鹽酸苯海拉明分別為125.0、250.0、500.0、750.0、1 000.0 μg·mL-1注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)樣量（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y = 1.046 7 X + 1.011，r = 1.000 0。結(jié)果表明鹽酸苯海拉明在125.0 ～ 1000.0 μg·mL-1的范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積值，鹽酸苯海拉明RSD為0.08%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取鹽酸苯海拉明軟膏（批號(hào)20131223）按“2.2”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別進(jìn)樣10 μL，標(biāo)示量%分別為100.90%、101.15%、100.45%、100.79%、101.17%、100.77%，RSD為0.27%（n = 6）。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份供試品溶液分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定鹽酸苯海拉明峰面積分別為528.5、528.2、528.5、528.4、528.9、527.7，RSD為0.08%。結(jié)果表明供試品溶液中鹽酸苯海拉明在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

按處方量稱取處方中除鹽酸苯海拉明以外的輔料，按制備工藝制成鹽酸苯海拉明的陰性樣品，取9份，分成3組，每組3份，每份約1.25 g。分別精密加入4.0、5.0、6.0 mL鹽酸苯海拉明對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法制成含量為標(biāo)示量的80%、100%、120%的樣品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖及峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示鹽酸苯海拉明的平均回收率為98.18%，RSD = 0.40%。詳見表1。

表1 鹽酸苯海拉明乳膏回收率實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for diphenhydramine hydrochloride cream. n = 9

2.9 樣品含量測(cè)定

取不同批號(hào)的樣品各3份（批號(hào)20131223、20131230、20131231），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，每份樣品重復(fù)進(jìn)樣2次，詳見表2。

表2 鹽酸苯海拉明乳膏含量測(cè)定結(jié)果. n = 3Tab 2 Contents determination of diphenhydramine hydrochloride in diphenhydramine hydrochloride cream. n = 3

3 討論

3.1 鹽酸苯海拉明含量測(cè)定方法的選擇

鹽酸苯海拉明含量測(cè)定方法主要有硝酸銀滴定法[1]、十二烷基硫酸鈉滴定法[1]，紫外分光光度法[8]，HPLC法[2-5]等。硝酸銀滴定法、十二烷基硫酸鈉滴定法無需特殊儀器，但滴定終點(diǎn)變化不明顯；紫外分光光度法，基質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響較大。有文獻(xiàn)[2-7]采用HPLC法測(cè)定鹽酸苯海拉明，可以有效避免基質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾，操作簡便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于醫(yī)療單位對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.2 HPLC法測(cè)定條件的優(yōu)化

3.2.1 檢測(cè)波長的選擇將對(duì)照品溶液置紫外分光光度計(jì)上，在200 ～ 350 nm進(jìn)行掃描，得鹽酸苯海拉明的紫外光譜圖。結(jié)果表明鹽酸苯海拉明在258 nm處有最大吸收且不受雜質(zhì)、輔料、溶劑的干擾，因此選擇258 nm為鹽酸苯海拉明的檢測(cè)波長。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇本實(shí)驗(yàn)曾用甲醇-1%三乙胺、乙腈-1%三乙胺[3-4]、甲醇-水-三乙胺[5]及不同比例的乙腈、水、三乙胺為流動(dòng)相，在乙腈-水-三乙胺（50∶50∶0.5）[9-10]的條件下測(cè)定鹽酸苯海拉明的含量不受雜質(zhì)干擾，且峰形好，靈敏度高，重現(xiàn)性和回收率好，完全能滿足該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求，為其質(zhì)量控制提供了可靠的定量方法參考。

3.2.3 溶劑的選擇本實(shí)驗(yàn)曾以甲醇、乙醇、流動(dòng)相分別作為溶劑提取鹽酸苯海拉明，其中采用流動(dòng)相作溶劑提取回收率高，且樣品溶液進(jìn)入色譜系統(tǒng)不會(huì)有不溶物質(zhì)析出，因此用流動(dòng)相作為提取劑。

3.2.4 色譜柱選擇文獻(xiàn)[9-10]測(cè)定鹽酸苯海拉明采用氰基柱，本實(shí)驗(yàn)曾采用氰基柱進(jìn)行試驗(yàn)，色譜柱沖洗及更換等操作繁瑣，氰基柱用于反相條件時(shí)CN鍵易水解，尤其是在pH 1.5 ～ 7.0的范圍以外，柱子使用壽命會(huì)下降較快。本實(shí)驗(yàn)采用常用ODS柱，不需頻繁更換色譜柱，柱效與氰基柱基本相同。建立的含量測(cè)定方法快速、簡捷、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，基質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾，分離效果好，能很好的用于鹽酸苯海拉明乳膏的含量測(cè)定。

3.3 穩(wěn)定性影響因素

（1）光照：將實(shí)驗(yàn)配置的對(duì)照品溶液，置自然光照下，于0、3、6、9、12、24 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積分別為530.5、529.4、530.1、530.0、529.7、529.9。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹽酸苯海拉明在24 h內(nèi)幾乎不受光照影響，實(shí)驗(yàn)過程中不必采取避光操作。

（2）酸性：文獻(xiàn)[10]表明，鹽酸苯海拉明經(jīng)酸破壞會(huì)產(chǎn)生二苯酮雜質(zhì)峰，本實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相pH 6.5為弱酸性。對(duì)照品溶液最終由流動(dòng)相（pH 6.5）定容，結(jié)合光照實(shí)驗(yàn)，可知鹽酸苯海拉明在pH 6.5溶液中較穩(wěn)定，不干擾本實(shí)驗(yàn)含量測(cè)定結(jié)果。

（3）溫度：本實(shí)驗(yàn)曾用不同水浴溫度（50 ～ 80 ℃）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明水浴溫度對(duì)鹽酸苯海拉明的穩(wěn)定性無影響。

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Content determination of diphenhydramine hydrochloride cream by HPLC

BAI Lin1, FAN Jin-zhao2, CAI Le1, XU Feng-hua1(1. Department of Pharmaceutical Care, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the content of diphenhydramine hydrochloride cream.Methods:HPLC analysis was carried out with Platisil C18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of acetonitrile-water-triethylamine (50 : 50 : 0.5), the detection wavelength was 258 nm, the fl ow rate was 0.8 mL·min-1and the column temperature was 40 ℃.Results:The samples were separated well from impurities by this HPLC method. The calibration curve of diphenhydramine hydrochloride was linear in the range of 125.0 – 1 000.0 μg·mL-1(r = 1.000 0). The average recovery and the RSD of diphenhydramine hydrochloride were 98.18%, 0.40% (n = 9), respectively.Conclusion:This method is accurate and feasible, which can be applied as the quantitative method for the determination of diphenhydramine hydrochloride cream.

HPLC; Diphenhydramine hydrochloride cream; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2014)06 – 0348 – 03

2014-03-03

2014-05-16）

總后制劑標(biāo)準(zhǔn)提高計(jì)劃重點(diǎn)課題：半固體制劑標(biāo)準(zhǔn)提高系列研究（13ZJZ05）

徐風(fēng)華，女，研究員，研究方向：藥物新劑型與新型遞藥系統(tǒng)研究。E-mail：xufh@yahoo.com

白林，女，主任藥師，研究方向：藥物分析與藥品質(zhì)量控制。E-mail：bailin301@126.com