四逆湯中甘草減附子之毒的代謝組學研究

李瑩 傅超美 彭偉 李波 傅舒 張慧敏

[摘要]基于GCMS代謝組學方法分析四逆湯和缺甘草四逆湯干預后大鼠血漿中的內源性代謝物變化，研究四逆湯中甘草對附子的減毒作用。18只SD大鼠，隨機平均分為正常組、四逆湯組和缺甘草四逆湯組。四逆湯組和缺甘草四逆湯組分別灌胃藥液（生藥質量濃度為08 g·mL-1），劑量為002 mL·g-1，每日1次，連續7 d；正常組給予等體積的生理鹽水。末次給藥05 h，收集血漿樣本，應用GCMS檢測。數據進行多元統計分析，得到14個潛在代謝標志物（指認13個），并對其相對含量及代謝途徑進行分析。與缺甘草方組相比，四逆湯組對7個代謝標志物進行了回調。通過對這些代謝標志物的生理功能分析，推測四逆湯中甘草可以通過調節方中附子對糖酵解、脂質代謝、三羧酸循環和部分氨基酸等生物代謝途徑的影響減低附子之毒性。

[關鍵詞]四逆湯；代謝組學；大鼠血漿；甘草；附子；減毒

[Abstract]To analyze the endogenous metabolite changes in rat plasma after intervention by Sini Tang and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma based on GCMS metabonomics technology， and study the toxicity reduction effect of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Sini Tang on Aconiti Lateralis Radix Preparata Eighteen SD rats were randomly divided into normal group， Sini Tang group and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group on average The rats in Sini Tang group and Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group were treated respectively with physic liquor by intragastric administration at the dose of 002 mL·g-1 （equivalent to 08 g·mL-1 crude drugs） once a day for 7 days The rats in normal group were given with equal volume of saline solution The plasma samples were collected from each rat 05 h after the last administration for GCMS detection The data was used for multivariate statistical analysis to obtain 14 potential metabolic markers（13 of them were identified） Then their relative content and metabolic pathways were analyzed Compared with Sini Tang without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma group， seven metabolic markers of were reduced in Sini Tang group Analysis on physiological functions of these potential metabolic markers showed that the Glycyrrhizae Radix et Rhizoma in Sini Tang could reduce the toxicity of Aconiti Lateralis Radix Preparata by adjusting the glycolysis， lipid metabolism， citrate cycle and some amino acids metabolism

[Key words]Sini Tang； metabonomics； rat plasma； Glycyrrhizae Radix et Rhizoma； Aconiti Lateralis Radix Preparatal； toxicity reduction

doi：10.4268/cjcmm20160826

四逆湯為張仲景所創急救之名方，始載于《傷寒雜病論》，由附子、甘草（炙）、干姜組成[1]，為1977年至現行各版《中國藥典》所收載[2]。臨床用于“少陰病，脈沉者”，癥見“吐利汗出，發熱惡寒，四肢拘急，手足厥冷”，主要用于治療冠心病、心絞痛、心力衰竭、多種原因所致的休克等心血管疾病，具有保護心肌、保護血管、抗休克、降血壓等藥理活性[35]。四逆湯中君藥附子為大辛大熱之品，回陽溫里，破陰逐寒；附子毒性峻烈，方中佐使甘草以解毒。如《景岳全書》所載：“附子之性急，得甘草而后緩；附子之性毒，得甘草而后解。”四逆湯各味藥煎煮后的藥物組分或代謝物進入血液循環，產生潛在而復雜的毒性與保護作用，最終輸送到心臟等靶點產生作用[6]。通過內源性代謝物表達水平的改變，分析研究機體對進入血液的藥物成分及機體應答所表征的“毒”與“解毒”[710]。

課題組前期已對體外模擬藥物組分隨血液循環作用于MIRI模型的H9c2心肌細胞而產生的內源性代謝物水平進行研究[11]。本研究采用GCMS分析四逆湯和缺甘草四逆湯干預后的大鼠血漿成分，運用代謝組學方法分析其大鼠血漿中的內源性代謝物變化，研究四逆湯中甘草對附子的減毒作用，從體內角度進一步闡釋四逆湯中甘草減附子之毒的作用機制。

1材料

7890A GC/5975 MSD氣相色譜質譜聯用儀（Agilent，美國）；METTLER AE240電子分析天平（Mettler Toledo，德國）；BF 2000/15A氮氣吹干儀（BFC 北京八方世紀科技有限公司）；WH3微型旋渦混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Heraeus Megafuge 10R通用離心機（Thermo，美國）。

甲醇、乙腈（Fisher Chemicals，美國）；甲氧胺鹽酸鹽，TMCS，MSTFA，吡啶，正庚烷（SigmaAldrich，美國）；乳酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、尿素、蘇氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、葡萄糖、肌醇、膽固醇等對照品均購自上海安研商貿有限公司；內標物白術內酯Ⅱ為實驗室自制（純度≥9985%）；實驗用水均為超純水（MilliQ級），其余試劑均為分析純。

附子（批號130205）購自四川江油中壩附子科技發展有限公司，炙甘草（批號130204）、干姜（批號130102）均購自四川科倫天然藥業有限公司，經西南民族大學劉圓教授鑒定，分別為毛茛科植物烏頭Aconitum caimichaeli Dobx子根、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch的干燥根及根莖的炮制品，姜科植物姜Zingiber officinale （Willd） Rosc 的干燥根莖，且均符合2015年版《中國藥典》規定。

清潔級SD健康大鼠，體重（200±20） g，雌雄各半，購自四川達碩實驗動物中心，動物生產許可證號SCXK（川）201324，飼養標準飼料和飲用水，試驗前12 h禁食不禁水。

2方法與結果

21四逆湯和缺甘草四逆湯樣品的制備

四逆湯和缺甘草四逆湯樣品的制備方法已在本課題組的前期研究中進行描述[1112]，各自制備得到生藥質量濃度08 g·mL-1的藥液。

22動物試驗

18只SD大鼠，隨機分別為3 組（正常組、四逆湯組、缺甘草四逆湯組），每組6只。

四逆湯組：灌胃預先溫熱的四逆湯藥液，劑量為002 mL·g-1，每日1次，連續7 d；缺甘草四逆湯：灌胃預先溫熱的缺甘草四逆湯藥液，其他同四逆湯組；正常組：灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥05 h，眼眶后靜脈叢采血，于預先肝素化的EP管中，以4 500 r·min-1離心10 min，分離血漿，于-70 ℃冷凍保存，備用。

23GCMS血漿樣品前處理

取血漿樣品于室溫解凍，精密吸取100 μL，接下來的制備方法已在本課題組的前期研究中進行描述[1112]，最后制得300 μL樣品溶液至GC進樣瓶，待測。

24GCMS分析系統

TR5MS毛細管柱（Agilent，美國，30 m×250 μm×025 μm）；高純氦氣為載氣，流速1 mL·min-1；進樣量10 μL，不分流進樣；進樣口溫度260 ℃；離子源（EI）溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電離電壓70 eV；He掃氣流量10 mL·min-1；掃描范圍m/z 30～600。升溫程序為：初始溫度70 ℃，保持4 min，以6 ℃·min-1升至115 ℃，以4 ℃·min-1升至126 ℃，以6 ℃·min-1升至190 ℃，以1 ℃·min-1升至194 ℃保持2 min，以3 ℃·min-1升至280 ℃。

25GCMS方法學驗證

251精密度試驗分別取等體積的正常組、四逆湯組和缺甘草方組的血漿樣品混合，作為質控樣品（QC），考察所建立GCMS方法的穩定性[1314]。按23項下方法處理質控樣品。將質控樣品隨機放于進樣序列中，分析9次。將輸出的GCMS圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2004年A版軟件進行評價，相似度大于0998，60個主要共有峰保留時間的RSD為0010%～015%（內標物保留時間的RSD為0010%），峰強度RSD為0030%～13%（內標物峰面積的RSD為36%），表明儀器精密度良好。

252穩定性試驗取四逆湯組血漿樣本，經2個凍融循環過程后，按23項下方法平行制備3份GCMS供試品。并將其中一份樣本放于進樣系統中，分別于0，8，16，24，36 h進行GCMS分析，將采集的GCMS圖譜采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2004年A版軟件進行評價，相似度大于0995，60個主要共有峰峰強度的RSD為037%～15%，表明血漿樣本經2個凍融循環過程后基本保持穩定，GCMS供試品在36 h內基本穩定。

26血漿組分GCMS代謝指紋分析

將采集的每組6個樣本的GCMS原始數據經格式轉換和標準化后，輸入到《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2004年A版軟件，對GCMS數據進行處理分析。分別采用中位數法生成與3組對應的3個對照譜圖（R1正常組，R2四逆湯組，R3缺甘草方組）并導出，將3個對照譜再次進行相似度評價（圖1，2）。

3個對照譜相似度計算結果為（R1R2 0988）>（R2R3 0964）>（R1R3 0938）。由相似度結果可知，四逆湯組與正常組的代謝物成分組最為接近，四逆湯組與缺甘草方組的代謝物成分組次之，正常組與缺甘草方組的代謝物成分組相差最大。

27數據分析

大鼠血漿GCMS總離子流（圖3）原始數據經預處理后，得到由質荷比、保留時間和強度構成的三維數據矩陣。根據所測的主要離子碎片信息，與AMDIS和NIST08質譜數據庫信息核對。經MATLAB（R2009a，The Math Works， Inc）軟件處理后，得到包括樣本名、保留時間、質荷比、歸一化后峰強度的數據矩陣。應用SIMCAP 130（Umetrics，瑞典）軟件對數據進行主成分分析（PCA）（圖4）、正交最小二乘分析（OPLSDA）（圖5）及最小二乘分析（PLSDA）分析（圖6）。OPLSDA，PLSDA模型分析中，采用CVANOVA檢查組間差異，結果均滿足P<0001，所建模型的組間差別均具統計學意義。

A，B，C區為TIC圖中局部放大。

圖3四逆湯組大鼠血漿GCMS總離子流圖

Fig3Typical total ion chromatogram of rats plasma Sini Tang group by GCMS

結合Splot與變量權重重要性排序VIP>1，篩選出14個代謝標志物（圖3）。14個代謝標志物的相對含量采用Minitab V150（State College，美國）軟件進行oneway ANOVA （置信區間95%）檢驗（表1）。

從圖5，6及表1可知，14個潛在代謝標志物中，與正常組比較，缺甘草方組中相對含量明顯升高的包括乳酸、L丙氨酸、β羥基丁酸、3磷酸甘油、谷氨酰胺、肌醇、未知物；缺甘草方組中相對含量明顯降低的包括纈氨酸、尿素、L亮氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、葡萄糖、膽固醇。與缺甘草方組比較，四逆湯組明顯進行回調的化合物包括乳酸、L丙氨酸、β羥基丁酸、3磷酸甘油、谷氨酰胺、葡萄糖、肌醇。

3討論

四逆湯中“附子之性毒，得甘草而后解”是機體處置四逆湯中復雜成分組之后的整體表征。采用GCMS對四逆湯組與缺甘草方組的大鼠血漿進行

物代謝途徑的影響得以實現的。

14個代謝標志物中乳酸鹽、葡萄糖和3磷酸甘油與糖酵解相關，表明四逆湯中甘草解附子之毒與糖酵解的途徑有關。與正常組比較，缺甘草方組中，乳酸和3磷酸甘油的含量水平升高，葡萄糖的含量水平降低[1516]。其中，乳酸鹽的水平下調，分析可能與機體中的相關乳酸脫氫酶調控有關。四逆湯組中因甘草與附子的藥物成分反應后再作用于機體，調控了相關乳酸脫氫酶的活性，使乳酸的含量顯著回調。缺甘草方組的葡萄糖含量升高可能是由于缺甘草四逆湯中附子與干姜“相須/相使”增強回陽之功但燥熱之性更甚，使機體對葡萄糖利用率下降[17]所致。缺甘草方組中3磷酸甘油含量升高，可能是附子毒性成分進入機體后抑制了糖酵解中第一個能量利用酶——甘油醛3磷酸鹽脫氫酶（GAPDH）活性有關[18]。

與正常組比較，缺甘草方組中膽固醇的含量上調，四逆湯組將膽固醇含量進行了回調，與四逆湯能降低血漿總膽固醇（TC）的作用[19]及甘草能降低膽固醇含量研究結果相一致[20]。同時，因四逆湯組的葡萄糖和纈氨酸等氨基酸含量均降低，其共同的代謝產物乙酰CoA也減少，以乙酰CoA為合成原料的膽固醇含量也相應降低[18]。

與正常組相比，缺甘草方組中α氨基酸（纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、脯氨酸）的含量均降低。附子中的毒性成分誘導心肌細胞消耗心肌能量，致ATP耗竭，而作為能量代謝的重要前體α氨基酸及其轉化為其他生物分子，α氨基酸的含量變化可能與缺甘草方中干姜與附子協同發揮辛熱而助陽之功有關，或此應激致使α氨基酸的代謝重構以滿足心肌細胞對能量的需求造成的[21]。同時，與缺甘草方組比較，四逆湯組僅對纈氨酸含量水平進行一定回調，相反對尿素的含量沒有進行回調反而下調。附子毒性的代謝組學研究結果[1516]顯示，β羥基丁酸與谷氨酰胺的含量水平降低，而本研究中缺甘草方組與正常組比較，二者的含量水平升高，相反四逆湯組中β羥基丁酸與谷氨酰胺的含量水平降低。據此分析，纈氨酸、尿素、β羥基丁酸和谷氨酰胺可能與缺甘草方組中的干姜對附子的毒性及增加附子藥效相關。

與正常組相比，缺甘草方組肌醇的含量升高，四逆湯組將肌醇的含量進行回調。肌醇可能與雙酯型烏頭堿對心臟的中毒機制有關，使Na+K+ATPase的活性[22]異常，心肌細胞Na+ 通道開放，Na+ 加速內流，產生心臟毒性[2324]，同時肌醇的含量升高；還可能為附子毒性成分干擾磷脂的生物合成，使肌醇的含量積蓄[18]；肌醇可能同時參與轉化1，6雙磷酸果糖（F1，6BP）而參與到糖酵解途徑[25]。一個未知成分在四逆湯組與缺甘草方組中的含量差異非常顯著，但其保留時間太靠后，與溶劑、保護氣等雜質峰混在一起，難以進行定性識別。

[參考文獻]

[1]張仲景. 傷寒雜病論（桂林古本）[M]. 南寧：廣西人民出版社，1980.

[2]中國藥典. 一部[S]. 2010：177.

[3]梁英明. 四逆湯治療冠心病心絞痛的臨床研究[J]. 中藥材，2005，28（8）：737.

[4]喻少峰. 四逆湯治療心力衰竭臨床療效及其對血漿BNP水平的影響[J]. 河南中醫，2014，34（5）：801.

[5]趙小祺，王春光，焦宏，等. 四逆湯對急性心肌梗死溶栓后再灌注損傷的保護作用[J]. 中國老年學雜志，2014，34（3）：590.

[6]Wang X，Sun W，Sun H，et al. Analysis of the constituents in the rat plasma after oral administration of Yin Chen Hao Tang by UPLC/QTOFMS/MS[J]. J Pharm Biomed Anal，2008，46（3）：477.

[7]Li X Z，Zhang S N，Lu F，et al. Cerebral metabonomics study on Parkinson′s disease mice treated with extract of Acanthopanax senticosus harms [J]. Phytomedicine，2013，20（13）：1219.

[8]張帥男，李煦照，王宇，等. 基于代謝組學分析的穿山龍對大鼠外周系統潛在干預作用的研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40（10）：2019.

[9]Lu F，Cao M，Wu B，et al. Urinary metabonomics study on toxicity biomarker discovery in rats treated with Xanthii Fructus [J]. J Ethnopharmacol，2013，149（1）：311.

[10]陳志敏，胡昌江，熊瑞，等. “二神丸”中補骨脂、肉豆蔻炮制前后對脾腎陽虛泄瀉大鼠血清代謝組學的影響[J]. 中國中藥雜志，2015，40（7）：1400.

[11]李瑩，傅超美，任波，等. 基于MIRI大鼠心肌細胞代謝組學研究四逆湯中附子配伍甘草解毒增效機制[J]. 中國中藥雜志，2014，39（16）：3166.

[12]李瑩，張慧敏，何瑤，等. 四逆湯制備工藝參數優化[J]. 中成藥，2013，35（6）：67.

[13]Gika H G，Theodoridis G A，Wingate J E，et al. Withinday reproducibility of an HPLCMSbased method for metabonomic analysis：application to human urine[J]. J Proteome Res，2007，6（8）：3291.

[14]Sangster T，Major H，Plumb R，et al. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLCMS and GCMSbased metabonomic analysis[J]. Analyst，2006，131（10）：1075.

[15]Sun B，Li L，Wu S，et al. Metabolomic analysis of biofluids from rats treated with Aconitum alkaloids using nuclear magnetic resonance and gas chromatography/timeofflight mass spectrometry[J]. Anal Biochem，2009，395（2）：125.

[16]Sun B，Wu S，Li L，et al. A metabolomic analysis of the toxicity of Aconitum sp. alkaloids in rats using gas chromatography/mass spectrometry[J]. Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23（8）：1221.

[17]Apontes P，Leontieva O V，Demidenko Z N，et al. Exploring longterm protection of normal human fibroblasts and epithelial cells from chemotherapy in cell culture[J]. Oncotarget，2011，3：222.

[18]吳梧桐. 生物化學[M]. 北京：人民衛生出版社，2005：196.

[19]羅漢川，黃河清，劉小霞，等. 四逆湯抗犬急性心肌缺血的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志，1999，15（11）：994.

[20]陳紅. 甘草藥理作用概述[J]. 海峽藥學，2005，17（4）：37.

[21]Carvalho R A，Sousa R P，Cadete V J，et al. Metabolic remodeling associated with subchronic doxorubicin cardiomyopathy[J]. Toxicology，2010，270（23）：92.

[22]傅敏新，錢榮立. 多元醇及肌醇代謝改變在糖尿病大血管病變中的作用[J]. 生理科學進展，1990，21（4）：300.

[23]王浴生. 中藥藥理與應用[M]. 北京：科技出版社，2000：592.

[24]郭春雨，管越強，劉波蘭. 溫度、pH和鹽度對克氏原螯蝦鰓Na+K+ATPase活性的影響[J]. 動物學雜志，2007，42（6）：96.

[25]譚光國. 中藥四逆湯化學物質組和代謝組學研究[D]. 上海：第二軍醫大學，2012.

[責任編輯曹陽陽]