超高效液相色譜泊聯質譜同時測定首烏藤中13種成分

羅益遠 劉娟秀 王鋒 劉訓紅 王勝男 華愉教 蘭才武

[摘要]建立超高效液相色譜串聯質譜法（UPLCMS/MS）同時測定首烏藤中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜蘆醇）、蒽醌（大黃素、大黃素甲醚、大黃素8βD葡萄糖苷、蘆薈大黃素）、黃酮（表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素）及酚酸（沒食子酸）等13種成分的方法。采用Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）色譜柱，流動相為水（含01%甲酸）乙腈，梯度洗脫，柱溫35 ℃，流速025 mL·min-1，采用電噴霧離子源（ESI），多反應離子監測（MRM）掃描方式進行檢測。采用TOPSIS法對13種成分進行分析評價。結果13種成分在一定濃度范圍內均呈良好的線性關系，相關系數大于0991 5，精密度、重復性和穩定性良好；加樣回收率在9524%～1023%，RSD均小于5%。TOPSIS分析顯示廣州產的樣品綜合質量較好。所建立的方法準確、專屬性、重復性較好，可用于首烏藤中多元功效物質或指標成分的同時測定，為首烏藤藥材內在質量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

[關鍵詞]首烏藤；UPLCMS/MS；二苯乙烯類；蒽醌；黃酮；酚酸；同時測定

[Abstract]A comprehensive analytical method based on UPLCMS/MS was developed for the simultaneous determination of thirteen components including three stilbenes （stilbeneglucoside， polydatin， resveratrol）， four anthraquinones （emodin， physcion， emodin8βDglucopyranoside， aloeemodin）， five flavonoids （epicatechin， rutin， hyperoside， astragalin，quercetin） and one phenolic acid （gallic acid） in Polygoni Multifori CaulisThe separation was carried out on a Waters BEH C18 column（21 mm×100 mm，17 μm）with gradient elution of acetonitrilewater （01% acetic acid） at a flow rate of 025 mL·min-1， and column temperature was 35 ℃ The target compounds were analyzed by multiple reaction monitoring （MRM） mode TOPSIS analysis ware performed to evaluate the samples from different areas and commercial herbs according to the contents of thirteen components The correlation coefficients of all the calibration curves were higher than 0991 5 The average recoveries ranged from 9524% to 1023%， and the relative standard deviations were less than 5% The result of TOPSIS analysis showed that the comprehensive quality of Polygoni Multifori Caulis sample from Guangzhou was better The developed method with good repeatability and accuracy was suitable for the simultaneous determination of multiple functional substances， which provided a new basis for the comprehensive assessment and overall control of the quality of Polygoni Multifori Caulis

[Key words]Polygoni Multifori Caulis； UPLCMS/MS； stilbenes； anthraquinones； flavonoids； phenolic acids； simultaneous determination

doi：10.4268/cjcmm20160818

首烏藤為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb的干燥藤莖，具有養血安神、祛風通絡的功效，臨床用于治療失眠多夢、血虛身痛、風濕痹痛、皮膚瘙癢[1]，已被列入衛生部公布的可用于保健食品的物品名單，其改善睡眠的主要有效成分為蒽醌類、黃酮類[23]。《中國藥典》2015年版一部首烏藤質量標準只規定了2，3，5，4′四羥基二苯乙烯2OβD葡萄糖苷的含量測定，而某些以首烏藤為主藥的復方制劑（如首珍顆粒、加味安爾眠顆粒等）則以蒽醌類成分為質控指標[45]。為確保以首烏藤為主藥的復方制劑的成品質量，需建立首烏藤中多元功效物質含量測定的方法，以全面控制首烏藤原藥材的內在質量。本實驗在前期研究基礎上[69]，采用超高效液相色譜串聯質譜（UPLCMS/MS）聯用技術同時測定首烏藤藥材中二苯乙烯（二苯乙烯苷、虎杖苷和白藜蘆醇）、蒽醌（蘆薈大黃素、大黃素8βD吡喃葡萄糖苷、大黃素和大黃素甲醚）、黃酮（表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷和槲皮素）和酚酸（沒食子酸）等13種成分的含量，結合TOPSIS分析[1013]，對首烏藤不同產地或商品藥材進行綜合評價，為首烏藤藥材的內在質量的綜合評價和全面控制提供科學依據。

1材料

超高效液相色譜TQD 質譜聯用儀，Acquity系統，Masslynx V41 工作站（美國Waters公司產品）；KQ500B超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司，超聲功率500 W，40 kHz）；BSA2245型電子分析天平（1/10萬，德國賽多利斯公司）；ME36S型電子分析天平（1/100萬，德國賽多利斯公司）。高速離心機（H1650W，湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）。

對照品二苯乙烯苷（批號110844200607）、大黃素（批號110756200110）、蘆薈大黃素（批號07959803）、大黃素甲醚（批號0758200206）、表兒茶素（批號10878200102）、沒食子酸（批號110831200302）、槲皮素（批號100081200907）、蘆丁（批號00809705）、金絲桃苷（批號111521200303）、槲皮素（批號100081200406）、紫云英苷（批號11092001）購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；虎杖苷（批號YY90052）、白藜蘆醇（批號YY90051）、大黃素8βD葡萄糖苷（批號YY90555）購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于98%。水為超純水（由Millipore純水器制備），乙腈、甲醇（色譜純，德國Merk公司），甲酸（色譜純，美國ROE公司），其余試劑均為分析純。

首烏藤藥材樣品均為實地采集或由相關醫療單位提供，編號及來源如下：S1采自南京中醫藥大學藥苑、S2采自江蘇省句容馬山、S3四川產，由江蘇省中醫院提供（批號131209）、S4湖北產，由南京大華中藥店提供（批號130901）、S5湖北產，由南京益大藥店提供（批號130614）、S6廣東產，由北京同仁堂南京店提供（批號130513046）。所有樣品均經南京中醫藥大學藥學院劉訓紅教授鑒定為何首烏P multiflorum的藤莖。留樣憑證保存于南京中醫藥大學中藥鑒定實驗室。

2方法與結果

21色譜條件

色譜柱Waters BEH C18（21 mm×100 mm，17 μm）；流動相水（含01%甲酸，A）乙腈（B）；梯度洗脫0～1 min，10% B；1～2 min，10%～90% B；2～3min，90% B；3～4 min，90%～10% B；4～5 min，10% B。柱溫35 ℃，流速025 mL·min-1，進樣量5 μL。

22質譜條件

離子化方式：電噴霧離子化（ESI），多反應監測離子掃描模式（MRM）測定，主要質譜參數為：脫溶劑溫度為400 ℃，錐孔氣體積流量為50 L·h-1，正離子模式下毛細管電壓為 35 kV，脫溶劑氣體積流量為 800 L·h-1；負離子模式下毛細管電壓25 kV，脫溶劑氣體積流量為550 L·h-1。13種成分的質譜具體參數見表1。

23對照品溶液制備

精密稱取表兒茶素642 mg、蘆丁211 mg、金絲桃苷150 mg、二苯乙烯苷213 mg、紫云英苷178 mg、白藜蘆醇263 mg、槲皮素155 mg、沒食子酸549 mg、蘆薈大黃素027 mg、大黃素8βD葡萄糖苷2520 mg、大黃素1485 mg、虎杖苷

238 mg、大黃素甲醚1460 mg對照品，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度。取各對照品母液適量，加甲醇配制成含上述對照品的混合儲備液，并逐級稀釋，得到一系列不同濃度的混合對照品溶液，4℃保存，備用。

24供試品溶液制備

取干燥恒重樣品粉碎過80目篩，精密稱取樣品粉末10 g，平行稱取2份，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL 70%甲醇，稱重，室溫下超聲提取45 min后取出，放冷以70%甲醇補足失重，靜置冷卻，保存于4 ℃。測定時精密吸取1mL，置于100 mL量瓶中，用初始流動相乙腈01%甲酸 1∶9定容至刻度，搖勻，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液經022 μm的微孔濾膜濾過，即得。

25線性關系、檢測限和定量限

精密吸取23項下混合對品照標溶液，置于10 mL量瓶中，用初始流動相乙腈01%甲酸水1∶9逐級稀釋制成一系列濃度的混合對照品溶液，按上述色譜質譜條件進樣分析，以對照品的峰面積（Y）對相應的濃度（X）進行線性回歸，得回歸方程、相關系數和線性范圍。以各化合的信噪比（S/N）等于3時相對應的濃度確定為最低檢測限（LOD），以各化合的信噪比（S/N）等于10時相對應的濃度確定為最低定量限（LOQ）。結果見表2， 圖1。

26方法學考察

精密度、重復性、穩定性試驗精密吸取同一混合對照溶液分別重復進樣6次，分別計算13種成分的峰面積的RSD；取同一樣品，按照樣品制備方法制備供試品溶液，進樣，重復測定6次，計算各成分的

含量的RSD；取同一樣品制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h測定13種成分的含量并計算其RSD，結果見表3。

加樣回收率試驗取已知含量的樣品05 g（6份），精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入一定量各對照品溶液，根據24項下方法制備加樣回收率供試品溶液，根據樣品測定方法進樣，計算各成分的平均回收率及RSD，結果見表3。

27樣品測定

取24項下各首烏藤供試品溶液，按照上述色譜質譜條件測定，根據相應線性關系計算供試樣品中13種成分的含量，測定結果見表4。

28Topsis分析

以各成分含量為分析指標，采用Topsis分析方法對首烏藤藥材中13種目標成分進行綜合分析評價，得出排序結果。

281歸一化處理將首烏藤藥材中13種目標成分的含量數據矩陣進行歸一化處理，建立相應矩陣，歸一化處理后的矩陣見表4。

αijXij/∑ni=1X2ij（原高優指標）

X′ij/∑ni=1（X′ij）2（原低優指標）

注：式中Xij表示第i個評價對象在第j個指標上的取值。X′ij表示經倒數轉換后的第i個評價對象在第j個指標上的取值，αij表示第i個評價指標在第j個評價指標上歸一化處理后的取值。

282最優方案與最劣方案根據歸一化處理后的矩陣得到最優值和最劣值向量，即有限方案中的最優方案（A+）與最劣方案（A-）

A+=（0548， 0536， 0416， 0488， 0593， 0612， 0495， 0655， 0631， 0539， 0998， 0877， 0800）

A-=（0256， 0179， 0396， 0373， 0216， 0153， 0322， 0095， 0241， 0352， 0005， 0080， 0096）

283Di+與Di-的計算分別計算各評價對象與最優方案及最劣方案的距離Di+與Di-

D+i∑10j=1（α+ij-αij）2

D-i∑10j=1（α-ij-αij）2

式中D+i與D-i分別表示第i個評價指標與最優方案及最劣方案的距離；αij表示某個評價對象i在第j個指標的取值。

284Ci的計算計算各評價對象與最優方案的接近程度。

Ci=D-iD+i+D-i

285Topsis分析方法按照Ci大小將各評價對象排序，Ci越大，表示綜合質量越好。首烏藤藥材的Topsis評價結果見表5。

3討論

31色譜條件的優化

實驗考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水等溶劑作為流動相，結果發現

采用乙腈作為流動相時的分離效果明顯優于甲醇，在流動相中加入一定比例的甲酸可增強樣品中待測物的保留，并減少色譜峰拖尾，從而提高分析方法的分離效果和靈敏度。因此本實驗采用乙腈01%甲酸水作為流動相梯度洗脫。

32質譜條件的優化

實驗同時選用正負2種離子模式測定13種目標成分的含量，其中二苯乙烯苷、白藜蘆醇選擇負離子模式，經過反復試驗考察，發現這幾種成分具有較好的穩定性，具有較高的響應值和更好的峰形。其他成分選擇正離子模式，也均能使各成分在檢測條件下更穩定，峰形及響應值更佳。

33供試品制備方法的優化

實驗中對提取溶劑（60%，70%，80%，90%，100%甲醇）、料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）及提取時間（15，30，45，60 min）進行了考察。結果表明，70%甲醇作為最適合的溶劑可以提取出更多待測物；以料液比1∶25，超聲提取45 min具有較好的提取效率。因此選擇以70%甲醇作為溶劑，料液比1∶25、超聲提取45 min。

34結果分析

測定結果表明，首烏藤藥材的13種指標成分中，以二苯乙烯苷和大黃素8βD吡喃葡萄糖苷的含量較高，其次為大黃素甲醚、大黃素及虎杖苷，這5種成分的總量達179%以上；不同產地及商品藥材中13種成分的含量有所差異，二苯乙烯苷、虎杖苷及沒食子酸的含量以廣州產樣品（S6）較高，所測4種蒽醌的總量、5種黃酮的總量以四川產樣品（S3）較高；所分析的首烏藤樣品中，其二苯乙烯苷含量均符合《中國藥典》2015年版一部的標準，僅單一成分為評價指標難以反映藥材的整體質量，測定多元指標成分的含量對中藥材的質量控制更為全面。由于首烏藤不同產地及商品藥材中多元指標成分含量不一，難以直觀評價，因而用TOPSIS分析法進行綜合評價，以克服了人為確定權重系數的片面性及主觀性，從而提高分析方法的可靠性。綜合評價結果顯示，廣州產首烏藤樣品（S6）的綜合質量較好。

本實驗建立了超高效液相色譜串聯質譜（UPLCMS/MS）技術同時測定首烏藤中二苯乙烯苷、虎杖苷、白藜蘆醇、蘆薈大黃素、大黃素8βD吡喃葡萄糖苷、大黃素、大黃素甲醚、表兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、紫云英苷、槲皮素、沒食子酸含量的方法，并對不同產地或商品藥材進行TOPSIS綜合評價，可為首烏藤藥材內在質量的綜合評價和全面控制提供新的方法參考。

[參考文獻]

[1]中國藥典. 一部[S]. 2015.

[2]李智欣， 楊中平， 石寶霞. 夜交藤中改善睡眠成分的研究[J]. 食品科學， 2007， 28（4）：327.

[3]汲廣全， 楊娟， 楊小生. 夜交藤改善睡眠活性成分研究[J]. 中成藥，2011，33（3）：514.

[4]呂霞. 首珍顆粒的藥學研究部分[D]. 成都 ：成都中醫藥大學， 2011.

[5]房海燕. 加味安爾眠顆粒的研制[D]. 濟南：山東中醫藥大學， 2006.

[6]羅益遠， 劉娟秀， 劉訓紅， 等. 不同采收期何首烏中多元功效物質的動態積累分析[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（13）：2565.

[7]羅益遠， 劉娟秀， 侯婭， 等. 何首烏不同產地及商品藥材中無機元素的ICPMS分析[J]. 中草藥， 2015， 46（7）：1056.

[8]羅益遠， 劉娟秀， 劉訓紅， 等. 超高液相色譜四級桿/線性離子阱質譜法同時測定不同產地何首烏中10種核苷類成分[J]. 分析測試學報， 2015， 34（5） ：519.

[9]羅益遠， 劉娟秀， 劉訓紅， 等. 何首烏和首烏藤的揮發性成分GCMS分析[J]. 中藥材， 2015， 38（10）：2113.

[10]孫振球. 醫學統計學[M]. 2版. 北京：人民衛生出版社， 2008：514.

[11]蘇澤春， 楊麗云， 徐中志， 等. TOPSIS法對金鐵鎖居群藥材質量的綜合評價[J]. 江西農業學報， 2014， 26（7）：42.

[12]顧志榮，王亞麗，孫宇靖，等. 熵權TOPSIS模型在甘肅產當歸藥材綜合質量評價中的應用[J]. 中藥材， 2014， 37（9）：1549.

[13]孟杰， 陳興福， 楊文鈺， 等. 基于灰色關聯度分析和DTOPSIS法綜合評價青川柴胡資源[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39（3）：433.

[責任編輯丁廣治]