中國沙棘和西藏沙棘葉中化學成分的UPLC/Q睺OF睲S快速分析

秦振嫻 張瑜 齊夢蝶 張權 劉爽 李旻輝 劉永剛 劉勇

[摘要]基于UPLC/QTOFMS技術對中國沙棘和西藏沙棘葉中的化學成分進行定性分析，比較兩沙棘葉中成分差異。采用Waters ACQUITY UPLCT3色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm），以乙腈（A）水溶液（B）為流動相梯度洗脫，體積流量05 mL·min-1；在電噴霧負離子模式下采集數據。離子源相關參數：毛細管電壓為2 000 V，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為100 ℃，碰撞氣體為氬氣，鞘流氣流量為900 L·h-1，鞘流氣溫度為450 ℃。結合質譜數據及文獻數據，分析、推斷出35個化合物，主要為黃酮類成分。其中，29個化合物為兩沙棘共有成分，剩余的6個成分中，2個成分為中國沙棘特有，其余為西藏沙棘獨有，研究表明兩沙棘葉在成分組成上差異較小。采用UPLC/QTOFMS技術，可有效地對中國沙棘和西藏沙棘葉中成分進行快速分析，為今后合理開發利用沙棘資源提供科學依據。

[關鍵詞]UPLC/QTOFMS；中國沙棘葉；西藏沙棘葉；黃酮類化合物

[Abstract]The study is aimed to analyze the chemical components in leaves of Chinese seabuckthorn and Tibetan seabuckthorn qualitatively and compare the differences between them by using ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupoletimeofflight mass spectrometry （UPLC/QTOFMS）The chromatographic separation of the components was achieved ona Waters ACQUITY UPLCT3 column （21 mm×100 mm， 17 μm）using gradient mobile phase consisting of acetonitrile （A） and aqueous solution （B） The identification of the separated compounds was performed on atandem mass spectrometry （MS/MS）by fragmentation patterns under the negative electrospray ionization The parameters of ion source were as follows：capillary voltage， 2 000 V； Cone voltage， 40 V The ion source temperature， 100 ℃； collision gas argon； sheath gas flow rate， 900 L·h-1； sheath gas temperature， 450 ℃ Through the analysis of mass spectrometry data and with the help of literature data， a total of 35 compounds were detected and most of them were flavonoids Among these compounds， 29 were common components for the two species， two components were unique to Chinese seabuckthorn and 4 were characteristic components of Tibetan seabuckthorn The results indicated that the compositions of the two kinds of seabuckthorn leaves were quite similar It is also demonstrated that UPLC/QTOFMS method could be applied to rapidly and effectively analyze and speculate the compounds in leaves of Chinese seabuckthorn and Tibetan seabuckthorn

[Key words]UPLC/QTOFMS； Chinese seabuckthorn； Tibetan seabuckthorn； flavonoids

doi：10.4268/cjcmm20160816

沙棘Hippophae rhamnoides L，胡頹子科沙棘屬植物，又名酸刺、沏其日干（蒙名）、達普（藏名）、吉汗（維吾爾名）等，《中國藥典》中以果實入藥，具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀的功效[12]。沙棘作為一種藥食同源植物，含有豐富的營養物質和生物活性成分，主要活性成分沙棘黃酮，在保護心血管系統、改善血液系統、增強免疫、抗氧化、抗癌、抗過敏、抑菌等方面均具有顯著的藥理活性，成為衡量沙棘產品質量和理化鑒別的重要指標[34]。近年來研究發現，沙棘葉中也含有大量活性成分，且具有產量大、易收集、采集周期長、生產工藝簡單、易貯藏等優于果實的自然優勢[5]。研究證實，紫外輻射、光照強度、溫度等環境因素均可明顯影響黃酮類成分的合成，從而導致化學成分變化（成分組成和含量變化）。本研究中所選用的2樣品中國沙棘和西藏沙棘葉地理分布和生長環境不同，前者分布于海拔800～3 600 m溫帶地區向陽的山嵴、谷地、干涸河床地或山坡，后者一般植株矮小，分布在海拔5 000 m以上的高寒地區的植株[6]。綜上所述，本實驗基于UPLC/QTOFMS技術，建立中國沙棘H. rhamoides subsp sinensis Rousi和西藏沙棘H tibetana Schlechtend葉中化學成分快速鑒定的分析方法，分析、比較兩沙棘葉中成分特征，不僅有利于闡明沙棘葉中的藥效物質基礎，也對今后科學開發沙棘資源和擴大沙棘原料來源有重要意義。

1材料

ACQUITY IClass 超高效液相色譜儀WatersXevoG2SQTOF MS質譜系統（美國Waters公司），數據采集與處理采用Masslynx 41軟件；BSA224S型1/1萬分析天平（德國Sartorius公司）；Centrifuge 5415D型離心機（德國Eppendorf公司）；SB800DTD型超聲清洗機，超聲功率500W（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Pacific TⅡ型超純水儀（美國Thermo公司）；022 μm hydrohpobic疏水PTFE微孔濾頭（Millipor公司，美國）。

槲皮素（批號 117395，純度≥98%）、蘆丁（批號 153184，純度≥98%）、槲皮苷（批號 522123，純度≥98%）、異鼠李素3O葡萄糖苷（批號 5041827，純度≥98%）對照品均購于上海源葉生物科技有限公司；山柰酚（批號 MUST13121112，純度≥98%，購于成都曼思特生物科技有限公司）；楊梅素（批號 529442，純度≥98%）、異鼠李素（批號 480193，純度≥98%）、異槲皮苷（批號21637252，純度≥98%）、鞣花酸（批號 476664，純度≥98%）對照品均購于北京四面體生物科技有限公司；水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純（美國Fishier Scientific公司），其余試劑均為分析純；沙棘葉采自內蒙古包頭，經北京中醫藥大學生藥系石晉麗教授鑒定其原植物為中國沙棘H. rhamoides subsp sinensis和西藏沙棘H tibetana。

2方法

21色譜條件超高效液相采用Waters ACQUITY UPLCT3色譜柱（21 mm×100 mm，17 μm，美國Waters公司）；流動相A為乙腈、B為水溶液，梯度洗脫0～2 min，5%～11%A；2～9 min，11%～23%A；9～95 min，23%～40%A；95～105 min，40%～60%A；105～11 min，60%～98%A；11～13 min，98%～98%A；13～133 min，98%～5%A；柱溫25 ℃；體積流量05 mL·min-1；進樣體積1 μL；紫外檢測波長190～400 nm。

22質譜條件質譜系統采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式掃描；掃描范圍m/z 50～1 500；離子源參數毛細管電壓為2 000 V，錐孔電壓為 40 V，離子源溫度為 100 ℃，鞘流氣為氮氣，900 L·h-1，鞘流氣溫度為450 ℃，掃描時間為02 s，碰撞氣體為氬氣。低能量掃描時碰撞能量為6 eV，高能量掃描時碰撞能量為25～45 eV。

23供試品溶液制備沙棘葉經50 ℃減壓干燥，粉碎，過50目篩，石油醚脫脂。稱量沙棘葉粉末1 g，加入甲醇15 mL，加熱回流2 h，放冷，濾過，殘渣再分別加125 mL甲醇，加熱回流2次，每次1 h，濾過，合并濾液，經微孔濾膜（022 μm）過濾，即得。

24對照品溶液制備精密稱取槲皮素、楊梅素、異鼠李素、山柰酚、槲皮苷、異槲皮苷、蘆丁、鞣花酸、異鼠李素3O葡萄糖苷各1 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得相應的9個對照品溶液。精密量取各標準儲備液適量，混勻，將此溶液用甲醇稀釋質量濃度至1 mg·L-1，過022 μm微孔濾膜，備用。

3結果與分析

31中國沙棘葉中化合物的鑒別沙棘葉中化合物主要為黃酮類物質，因黃酮類化合物分子中的羥基易形成穩定的氧負離子，使用ESI 離子源，負離子模式檢測所得總離子流圖（圖1）信噪比好，有較低的背景值，并且負離子模式形成的母離子通常為[M-H]-，比較單一，易于辨識[79]。所得總離子流圖與紫外檢測色譜圖基本吻合。通過對色譜峰做二級質譜研究，35個化合物的準確相對分子質量和離子碎片信息（表1）。根據[M-H]-準分子離子峰計算出元素組成，結合保留時間及裂解碎片信息，與文獻報道[1021]的化學成分及對照品進行分析比對，初步推斷中國沙棘和西藏沙棘葉中成分的結構。

32中國沙棘和西藏沙棘葉中化合物的結構解析峰1：二鞣花酰基葡萄糖。質譜給出準分子離子峰m/z 783070 7 [M-H]-，推斷其分子式為C34H24O22，以m/z 783070 7作為母離子進行二級質譜分析，所得二級質譜圖中有明顯的481，437，301，257，229，185 碎片離子信息。481 [M-H-302] -是[M-H]-丟失鞣花酰基（HHDP）形成的碎片離子，301 [M-H-302-180] -是繼而丟失1個葡萄糖分子形成的碎片離子，437 [M-H-302-44] -是481丟失1個CO2分子形成的碎片離子，m/z 301失去1個CO2、繼而失去1個CO或失去2分子CO2和1分子CO產生與標樣鞣花酸相同的特征離子峰（m/z 257，229，185），表明其含有鞣花酰基。

峰2、峰3：二鞣花酰基葡萄糖。 兩峰質譜均給出[M-H]-為783的準分子離子峰，對其做二級質譜分析，所得二級質譜圖中碎片離子均有明顯的481，301，257，229，185，依據此信息并結合文獻，認定其同峰1，為二鞣花酰基葡萄糖，三者互為同分異構體。

峰4：沒食子酰基鞣花酰基葡萄糖。 質譜準分子離子峰為m/z 633073 1[M-H]-，推斷其分子式為C27H22O18，以m/z 633073 1作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的463，301，257，229，185碎片離子。463[M-H-170]-是母分子離子丟失沒食子酸，301[M-H-332] -是母分子離子失去沒食子酰基與葡萄糖組成的化合物形成的。m/z 301產生的碎片離子與標樣鞣花酸的碎片離子相同。

峰5、峰12：鞣花酰基橡椀酰基葡萄糖。 兩峰質譜均給出準分子離子峰m/z 935 [M-H]-，推斷其分子式為C41H28O26，以m/z 935作為母離子進行二級質譜分析，得到891，783，633，481，301碎片離子。891[M-H-28]-是其母離子失去1分子CO；碎片783[M-H-152]-是其母離子失去1分子沒食子酰基形成，相繼丟失2分子沒食子酰基分別形成碎片離子633和481，相當于其母分子離子丟失橡椀酰基；481丟失1分子葡萄糖得到碎片離子301；m/z 301產生與標樣鞣花酸相同的碎片離子，表明其含有鞣花酰基。依據此信息并結合文獻，峰5、峰12被認定為鞣花酰基橡椀酰基葡萄糖。

峰6：槲皮素7O鼠李糖苷。 質譜給出準分子離子峰m/z 447149 3[M-H]-，推斷其分子式為C21H20O11，以m/z 447149 3作為母離子進行二級質譜分析，碎片301[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖形成，m/z 301產生與標樣槲皮素相同的特征離子峰271，179，151，表明母核是槲皮素。

峰7：槲皮素3O槐糖7O鼠李糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 771200 1 [M-H]-，推斷其分子式為C33H40O21，以m/z 771200 1作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的625，447，301碎片離子信息。碎片625[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖，相繼丟失2分子葡糖糖，產生碎片離子301[M-H-146-162-162]-，m/z 301產生與標樣槲皮素相同的特征離子峰271，179，151，化合物母核是槲皮素。

認定其為異槲皮苷。

峰22：異鼠李素3O槐糖O乙酰葡萄糖7O鼠李糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 991273 6 [M-H]-，推斷其分子式為C42H55O27，以m/z 991273 6作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的845，785，639，461，460，315，313碎片離子。碎片845[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖，785[M-H-146-60]-是母離子失去1分子CH3COOH，639是失去1分子乙酰化葡萄糖，639相繼丟失2分子葡萄糖產生碎片離子315。

峰23：異鼠李素3O阿拉伯糖7O鼠李糖苷。其準分子離子峰m/z 593151 5 [M-H]-，推斷其分子式為C27H30O15，以m/z 593151 5作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的461，460，447，315，313碎片離子信息。碎片461[M-H-132]-是母離子丟失1分子阿拉伯糖，447[M-H-146]-是母離子失去1分子鼠李糖，315[M-H-146-132]-產生與標樣異鼠李素相同特征離子峰300，271，151，107，母核是異鼠李素。

峰24、峰29、峰30、峰31：山柰酚3O葡萄糖鼠李糖苷。質譜均給出593 [M-H]-的準分子離子峰，可推斷其分子式為C27H30O15，以m/z 593作為母離子，對其進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的284，285 [M-H-Rha-Glc]-碎片離子信息，是其母分子離子依次失去鼠李糖（146）和葡萄糖分子（162）分子產生的。

峰25：槲皮素7O鼠李糖苷。其準分子離子峰m/z 447055 3[M-H]-，推斷其分子式為C21H20O11，和峰7互為同分異構體。以m/z 447055 3作為母離子進行二級質譜分析，碎片300，301[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖形成。

峰26：山柰酚3O葡萄糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 447091 2[M-H]-，推斷其分子式為C21H20O11，和峰24是同分異構體。以m/z 447091 2作為母離子進行二級質譜分析，碎片284，285[M-H-162]-是母離子丟失1分子葡萄糖形成。

峰27：異鼠李素3O蕓香糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 623161 1[M-H]-，推斷其分子式為C28H32O16，以m/z 623161 1作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的315 [M-H-Rha-Glc]-碎片離子信息，是其母分子離子依次失去鼠李糖（146）和葡萄糖分子（162）分子產生的。

峰28：異鼠李素3O葡萄糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 477102 7[M-H]-，推斷其分子式為C22H22O12，以m/z 477102 7作為母離子進行二級質譜分析，碎片314，315[M-H-162]-是母離子丟失1分子葡萄糖形成。

峰32：槲皮素3O蕓香糖7O葡萄糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 771200 0 [M-H]-，推斷其分子式為C33H40O21，以m/z 771200 0作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有609，463，301，299碎片離子信息。碎片609 [M-H-162]-是母離子丟失1分子葡萄糖，相繼丟失1分子鼠李糖產生463[M-H-162-146]-，丟失1分子葡萄糖產生碎片離子301[M-H-162-146-162]-，m/z 301產生與標樣槲皮素相同的特征離子峰271，179，151。

峰33：槲皮素3O葡萄糖鼠李糖7O鼠李糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 755205 4[M-H]-，推斷其分子式為C27H30O17，以m/z 755205 4作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的609，463，446，301，300碎片離子信息。碎片609 [M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖，繼而失去1分子鼠李糖得到碎片463[M-H-146-146]-、再失去1分子葡萄糖得到碎片301[M-H-146-146-162]-。

峰34：山柰酚3O槐糖O葡萄糖醛酸7O鼠李糖苷。質譜給出準分子離子峰m/z 931254 5[M-H]-，推斷其分子式為C39H48O26，以m/z 931254 5作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的785，609，285，284碎片離子信息。碎片785[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖，繼而母離子失去1分子葡萄糖醛酸得到609[M-H-176]-，609相繼丟失2分子葡萄糖，即得碎片離子285。

峰35：異鼠李素3O槐糖O葡萄糖醛酸7O鼠李糖苷。質譜給出準分子離子峰961264 2[M-H]-，推斷其分子式為C40H50O27，以m/z 961264 2作為母離子進行二級質譜分析，所得譜圖中有明顯的815，785，461，315碎片離子信息。碎片815[M-H-146]-是母離子丟失1分子鼠李糖；母離子失去1分子葡萄糖醛酸得到785[M-H-176]-，繼而相繼丟失2分子葡萄糖，即得碎片離子461。

4討論

41測定方法的選擇UPLC/QTOFMS分析具有速度快、靈敏度高、分離度高，可測得化合物精確相對分子質量等特點，適用于中藥多組分、復雜成分的分離和定性鑒別[8]。本實驗首次運用該技術，對中國沙棘和西藏沙棘葉中成分進行全面、快速的成分分析，為沙棘葉中化學物質基礎研究提供了更為快速有效的手段。

42色譜和質譜條件的選擇乙腈溶劑黏度較低，洗脫能力大于甲醇，作為有機溶劑，能夠使色譜峰快速分離。實驗結果表明，以乙腈水作為流動相得到的色譜峰形、分離效果和質譜信號響應最優[8]。因黃酮類化合物分子中的羥基易形成穩定的氧負離子，使用ESI離子源，負離子模式檢測所得總離子流圖信噪比好，有較低的背景值且負離子模式形成的母離子通常為[M-H]-，比較單一，易于辯識，故選擇負離子模式采集數據。

43沙棘葉中黃酮類化合物的質譜裂解規律黃酮類化合物在ESI離子源下的裂解方式主要是產生脫去糖基的碎片離子。中國沙棘和西藏沙棘葉中的黃酮苷類主要含有葡萄糖和鼠李糖，因此主要產生丟失該糖基的[M-H-162]-和[M-H-146]-的碎片離子；對于黃酮母核，主要發生C環的RDA裂解和一些小分子碎片的丟失，如CO，CHO，C3O2，CO2等。

44中國沙棘和西藏沙棘葉中成分分析比較本實驗基于UPLCQTOFMS技術對中國沙棘和西藏沙棘葉中成分進行了分離及結構鑒定。根據各個色譜峰在質譜中的精確相對分子質量、質譜碎片結構信息，與文獻報道的相關成分作比對，成功鑒定出35個化合物。其中，鞣花酸、蘆丁、異槲皮苷、異鼠李素3O葡萄糖苷與對照品對照后進行確認；其他峰則通過二級質譜掃描MS2，根據特征碎片離子峰進行確認。

分析本實驗結果，在成分組成上，中國沙棘和西藏沙棘葉中成分大體一致，主要是以槲皮素、山柰酚、異鼠李素為苷元和糖結合形成的黃酮苷類物質。所鑒定的35個化合物中，29個成分為兩沙棘葉所共有，而楊梅素3O鼠李葡萄糖苷和異鼠李素3O阿拉伯糖7O鼠李糖苷2成分為中國沙棘獨有；余下4個成分槲皮素3O蕓香糖7O葡萄糖苷、槲皮素3O葡萄糖鼠李糖7O鼠李糖苷、山柰酚3O槐糖O葡萄糖醛酸7O鼠李糖苷以及異鼠李素3O槐糖O葡萄糖醛酸7O鼠李糖苷為西藏沙棘獨有；中國沙棘和西藏沙棘葉中成分在含量上也存在差異。利用Masslynx 41軟件經去噪、基線校正、重疊峰解析及峰對齊獲得了2種沙棘葉中35種化學成分的相對定量信息，結果表明，對于2沙棘葉的主要成分（例如，14，15，18，28以及30號峰等）而言，中國沙棘約為西藏沙棘含量的15倍，6個特異性成分含量相對主成分而言含量很低。但本實驗是對2種沙棘葉單個產地的定性分析，對2沙棘葉中成分做后續研究時，可以化學成分含量變化為研究出發點，收集不同產地和批次的2種沙棘葉，進一步綜合研究、分析2沙棘葉中成分特征。

本實驗建立的沙棘葉中化學成分快速分析的方法，能夠快速、有效地闡明沙棘葉中化學成分，對今后科學開發沙棘資源和擴大沙棘原料來源有重要意義。

[參考文獻]

[1]劉勇，廉永善，王穎莉，等. 沙棘的研究開發評述及其重要意義[J]. 中國中藥雜志，2014，39（9）：1547.

[2]中國藥典. 一部[S]. 2015.

[3]Kumar M S Y， Dutta R， Prasad D， et al. Subcritical water extraction of antioxidant compounds from Seabuckthorn （Hippophae rhamnoides） leaves for the comparative evaluation of antioxidant activity[J]. Food Chem， 2011， 127（3）：1309.

[4]Wang J， Zhang W， Zhu D， et al. Hypolipidaemic and hypoglycaemic effects of total flavonoids from seed residues of Hippophae rhamnoides L. in mice fed a highfat diet[J]. J Sci Food Agr， 2011， 91（8）：1446.

[5]杜蕾蕾，陳雛. 不同沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量比較[J]. 成都醫學院學報， 2015（1）：28.

[6]廉永善，陳學林，于倬德，等. 沙棘屬植物起源的研究[J]. 沙棘，1997（2）：1.

[7]孫冬梅，董玉娟，胥愛麗，等. UPLCQTOFMS法快速篩查銀杏磷脂軟膠囊中12種黃酮類化合物[J]. 中成藥，2015（2）：320.

[8]孫冬梅，董玉娟，胥愛麗，等. 葛根枳椇軟膠囊中黃酮類化合物的UPLC/QTOFMS快速分析[J]. 中草藥， 2015（7）：970.

[9]單鳴秋，錢雯，高靜，等. UPLCMS分析側柏葉中黃酮類化合物[J]. 中國中藥雜志，2011，36（12）：1626.

[10]王克建，杜明，胡小松，等. 核桃仁中多酚類物質的液相/電噴霧質譜分析[J]. 分析化學，2009（6）：867.

[11]王克建，郝艷賓，齊建勛，等. 紅色核桃仁種皮提取物紫外可見光譜和質譜分析[J]. 光譜學與光譜分析，2009（6）：1668.

[12]芮雯，范賢，岑穎洲，等. 千斤拔中黃酮類成分的UPLC/QTOFMS分析[J]. 中成藥，2012（3）：509.

[13]Ablajan K， Abliz Z， Shang X Y， et al. Structural characterization of flavonol 3， 7diOglycosides and determination of the glycosylation position by using negative ion electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. J Mass Spectrom， 2006， 41（3）：352.

[14]Guliyev V B， Gul M， Yildirim A. Hippophae rhamnoides L. ：chromatographic methods to determine chemical composition， use in traditional medicine and pharmacological effects[J]. J Chromatogr B， 2004， 812（1）：291.

[15]Chen C， Xu X M， Chen Y， et al. Identification， quantification and antioxidant activity of acylatedflavonol glycosides from sea buckthorn （Hippophae rhamnoides ssp. sinensis）[J]. Food Chem， 2013， 141（3）：1573.

[16]馬欣，孫毓慶. 高效液相色譜紫外電噴霧質譜法分析銀杏葉中黃酮醇苷類化合物[J]. 沈陽藥科大學學報，2003（4）：275.

[17]趙琴琴，張玉峰，范驍輝. 高效液相色譜多級質譜聯用法同時鑒定苦參中的兩大類活性成分[J]. 中國中藥雜志，2011，36（6）：762.

[18]張語遲，劉春明，劉志強，等. 羅布麻葉黃酮類成分酶解前后的液相色譜質譜分析及活性比較[J]. 分析測試學報， 2010（10）：1073.

[19]趙春艷. 沙蔥中黃酮類化合物的分離純化、結構鑒定及其對小鼠免疫抗氧化機能影響的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2008.

[20]曹會凱. 山楂中黃酮類化合物的提取及成分分析[D]. 秦皇島：河北科技師范學院， 2013.

[21]曹捷. 紫花地丁黃酮苷類成分的定性定量研究[D]. 上海：復旦大學，2013.

[責任編輯丁廣治]