白及種子萌發及原球莖發育過程的細胞組織學觀察

聶寧 朱艷 田梅 華靜雯 王龍 秦民堅

[摘要]為探討白及種子發育成苗的機制，對組織培養條件下種子萌發過程和原球莖發育過程進行了形態學和石蠟切片細胞組織學觀察。結果表明：白及種子吸水膨脹后，出現極性，遠離胚柄端分化出綠色芽點，芽點發育成子葉，同時種胚突破種皮形成原球莖，另一端則出現成群的白色絨毛狀假根。原球莖頂端分生組織的發育遵循原套原體學說，內部分化出多束維管束后，白及由原球莖過渡到根狀莖階段。其中根原基的發育始于根狀莖維管束，為內起源。當根狀莖逐漸膨大，內部基本分生組織分化為成熟薄壁組織后，假鱗莖開始形成。白及種子的發育共經過種胚、原球莖、根狀莖和假鱗莖4個階段。

[關鍵詞]白及；原球莖；細胞組織學

[Abstract]In order to investigate the mechanism of growth for Bletilla striata， which could be applied for rapid propagation， morphological and cytohistological of seed germination and protocorm development in vitro culture were observed using paraffin section techniques In this study， we have found that the development of B striata goes through four stages： embryo， protocorm， rhizome and pseudobulb The end away from embryo suspensor is able to differentiate green buds after the seed of B striata swelling， growing point At the same time， the other end of embryo grows many white villous roots， with the green bud differentiating into cotyledon， the embryo breaking through seed coat and being protocorm The shoot apical meristem of protocorm consists of tunica， corpus and leaf primordium， whose developmental flowing tunicacorpus theory After more vascular bundle appeared from the leaf primordium， B striata grows into the stage of rhizome While in the stage of rhizome， the root primordium of tissue culture seedlings are differentia initially that derived from rhizome vascular bundle， belonging to internal origin Subsequently， the pseudobulb forms by the inner meristem growing into mature parenchymatous tissue and the rhizome enlargement gradually

[Key words]Bletilla striata； protocorm； cytohistological

doi：10.4268/cjcmm20160813

白及Bletilla striata（ Thunb ） Reichb f 為蘭科白及屬藥用植物，以干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，主治咯血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂[1]等癥，是我國民間常用中藥[23]。白及不僅具有較高的藥用價值，同時在化妝品行業[45]和園藝業前景也很廣闊，具有較高的市場經濟價值。白及自然繁殖系數低，生態環境破壞以及過度采挖和資源不合理利用，造成了白及資源供需之間的緊張狀況。傳統繁殖方法多采用挖掘野生資源進行分株繁殖，但這種繁殖方式周期長，效率低[6]，難以滿足市場需求。植物組織培養作為白及的一種繁殖方式[7]，解決了白及種子無法正常萌發而導致繁殖周期較長、繁殖率低的難題。近年來有關白及組織培養快速繁殖報道較多[8]，但有關白及種子及原球莖發育的解剖學研究尚未見報道。本研究以組織培養為基礎，觀察白及種子不同發育時期的內部結構變化，以期為白及快速繁殖機制研究奠定細胞組織學基礎。

1材料

白及果實采于南京中山植物園，經中國藥科大學中藥學院秦民堅教授鑒定為蘭科植物白及的成熟蒴果。憑證標本存放于中國藥科大學中藥資源教研室。

2方法

21種子萌發

取白及成熟未開裂蒴果，自來水下洗去泥沙灰塵，經洗衣粉水浸泡20 min，自來水反復沖洗，RO水潤洗干凈后置于超凈臺。消毒步驟：75%乙醇浸泡1 min，無菌水潤洗2次，NaClO溶液（有效氯≥5%）浸泡10 min，無菌水反復潤洗5次，隨后用無菌濾紙拭干表面水分，解剖刀縱向切開，將種子均勻撒播在備好的萌發培養基上。

萌發培養基為1/2MS+NAA 05 mg·L-1，培養條件：（26±2） ℃；光照度1 500～2 000 lx；光照時長11 h·d-1。自播種之日起每隔2 d取樣1次，光學顯微鏡下觀察種子萌發形態變化，同時樣品用FAA固定液固定，備用。

22原球莖發育

待種子萌發至原球莖階段后，即進行繼代培養，將原球莖按3～5個為1叢，每瓶接種8～10叢，培養約60 d后，轉入壯苗培養基培養。

培養基為MS培養基（繼代培養），MS+NAA 02 mg·L-1+6BA 20 mg·L-1+土豆汁75 g·L-1（壯苗培養）。培養條件為（26±2） ℃，光照強度1 500～2 000 lx，光照時長11 h·d-1。待原球莖培養15，30，60 d，以及長成帶葉小苗分別取樣，FAA固定液固定，備用。

23種子萌發和原球莖發育過程中的形態解剖學觀察

觀察不同時期種子萌發和原球莖發育結構變化，并以其為材料進行常規石蠟切片法制片，切片機（820 Histo STAT Reichert）切片，切片厚度8 μm，海氏蘇木精染色，光學顯微鏡（Nikon Eclipse E200）下觀察。

3結果與分析

31形態學觀察

311種子萌發形態學觀察白及種子細小，構造簡單，顯微鏡下觀察種胚呈紡錘形，由1層透明的種皮包裹，播種時種胚呈棕黃色，一端具殘留的胚柄（圖1，A）。2 d后種子吸水膨脹開始變綠，遠離胚柄的一端漸漸呈凸起狀（圖1，B），此時白及種子由異養向自養轉換[9]。繼續培養，6 d后種胚發育生長開始撐破一端的種皮，進入原球莖階段（圖1，C）。培養基上觀察可發現，與種胚凸起相對的一端出現白色絨毛狀“假根”[10]，猜測為種子吸收營養成分的結構。培養10 d后種子迅速萌發，完全突破種皮，頂端已經有了葉原基的分化（圖1，D），接著4 d后，種子分化出子葉（圖1，E），形成小苗。培養20 d，白及開始長出幼葉（圖1，F）。該萌發動態過程與王楷[11]、張燕[12]等研究一致。

312原球莖發育形態學觀察當原球莖轉入繼代培養基15 d后，植株基部長出大量毛狀根，有的已經形成明顯的不定根，同一瓶中生長狀態并不統一，發育較快的小苗甚至已分化出第3片小葉。繼續培養，組培苗不斷生長，葉片舒展，植株增高，基部由最初的球形原球莖轉變為長條狀的根狀莖結構，此時根部正在大量吸收養分以滿足植株迅速發育。待小苗長至1～15 cm 時轉入壯苗培養基中，小苗莖、葉的長勢漸緩，但根狀莖明顯變粗，呈球形，進入假鱗莖階段；在激素的作用下，假鱗莖基部分化出不定根，更有利于吸收營養。

32細胞組織學觀察

321種子萌發的細胞組織學觀察白及種胚表面為1層體積小，排列緊密的細胞，中間細胞體積

較大，內含物較多（圖2，A），培養2 d后，一端出現極性，開始分化出較多體積小，質濃，核大的細胞，隨著培養時間變長，這部分的細胞不斷增殖分化逐漸凸起，向種皮合點端突破，形成原球莖。原球莖頂端的原分生組織進一步分化出葉原基，形成子葉（圖2，B）。原球莖繼續發育，頂端分生組織在不斷分化出葉原基的同時，向內逐漸分化出一束維管束，表皮始終為一層細胞：排列緊密，細胞體積小，細胞核大，居于中央。顯微下觀察發現維管束周圍圍繞著一團分生組織細胞，不斷分化出維管組織細胞（圖2，C），使得維管束不斷向基部延伸，最終起到連接根和葉的作用。

322原球莖發育細胞組織學觀察原球莖培養30 d的縱切面最大剖面頂端分生組織結構圖（圖2，D），原球莖頂端分生組織的發育遵循原套原體學說[1314]。圖2中所示A，B分別為原套和原體，在其以下部位為葉原基。莖頂端的分生區細胞向外分化成幼葉的同時，向內形成維管束。當維管束由一束分化成多束時，白及由原球莖階段進入根狀莖階段。隨著幼葉的發育，基部的分生組織分化為居間分生組織，其結果是使葉片不斷伸長變寬；維管束周圍包裹著一團細胞核較大、體積較小、排列緊密的分裂細胞，共同構成原形成層。原形成層細胞代謝活動旺盛，分裂能力強，同時也在不斷分化出維管束細胞和薄壁細胞（圖2，E），向與頂端分生組織相對的基部延伸。根狀莖階段，內部組織出現大量核大，液泡小的細胞，越靠近頂端分生區的細胞體積越小，排列越緊密，為基本分生組織細胞，來源于初生分生組織結構，其分裂衍生的細胞可促進根狀莖擴大。繼續培養，根狀莖基部開始分化出不定根，白及的不定根起源于由頂端延伸至基部的維管束鞘結構，屬于內

LP葉原基； EP表皮； SAM 頂端分生組織； VB 維管束； RhVB 根狀莖維管束； RVB 根維管束； Sc 厚壁組織； En內皮層； Pe 中柱鞘； PX初生木質部； PP 初生韌皮部；A種胚縱剖面顯微圖； B 種子萌發10 d縱剖面顯微圖； C 種子萌發16 d縱剖面顯微圖； D 培養30 d 原球莖縱剖面顯微圖； E 具維管束的根狀莖縱剖面顯微圖； F 根維管束開始出現； G 成熟不定根橫切面顯微圖； H 根狀莖縱剖面顯微圖； I 假鱗莖開始形成； J 假鱗莖縱剖面顯微圖。

圖2白及種子萌發及原球莖發育顯微解剖

Fig2Microscopic anatomy of seed germination and protocorm development

起源[15]。維管束鞘中的一部分細胞經脫分化，恢復分裂能力，細胞質變濃、核變大、液泡縮小，形成根原基細胞。根原基不斷分化、伸長，從而形成不定根（圖2，F）。在繼代培養基中，白及發育迅速，根狀莖頂端不斷分化出幼葉，每一片幼葉基部向外分裂增生，使葉片伸長，向內分裂分化成維管組織，最終與基部的不定根連接。隨著不定根的生長，最早形成的子葉逐漸脫落，與其相連的薄壁組織也漸漸退化（圖2，H）。將小苗轉入壯苗培養基后，根狀莖基部漸漸膨大，基本分生組織分化為液泡較大的薄壁組織，開始積累養分，假鱗莖初始形成。在激素的作用下，假鱗莖葉腋處開始分化出多個芽原基（圖2，I），為不定芽的起點，不定芽不斷發育生長，最終形成完整小苗，基部生成不定根，與母體剝離。而此時母體發育的速度漸漸放緩，假鱗莖逐漸增粗，內部形成大量的薄壁細胞（圖2，J），根部組織也已發育成熟（圖2，G）。

4討論

白及由種子發育為完整植株大致經過4個階段：種胚、原球莖、根狀莖、假鱗莖。

41種胚原球莖的轉化

白及種子不含胚乳，在解剖鏡下分離開種皮后，為1個橢球形的種胚，縱切面和橫切面觀察發現無胚根、胚軸和胚芽的分化，僅由1層排列緊密的表皮細胞包裹著內含物較多的薄壁細胞。白及幼葉起源于種胚具有極性一端的分生組織的外部細胞，屬于外起源[14]，白及種子萌發時不形成胚根，而是先膨脹變綠[12]，待種胚發育為原球莖后，其基部通過表皮細胞的凸起產生大量白色絨毛狀“假根”，來吸收培養基上的水分和營養物質。所謂原球莖是蘭科種子萌發過程中的一種形態學構造，種子萌發初期，經吸水膨脹，突破種皮形成的球形或橢球形的結構[16]，白及種子萌發大約8～10 d即可形成原球莖。原球莖代謝活動旺盛，遺傳性狀穩定[16]，利用原球莖進行繼代培養可迅速獲得增殖小苗，是白及快繁技術的關鍵。

42原球莖根狀莖假鱗莖的轉化

白及發育過程大致遵循蘭科基本發育規律。原球莖分化出多束維管束，進入根狀莖階段。根狀莖維管束為外韌型維管束，無束中形成層，其生長發育過程中，維管束數目不斷增多，為典型的單子葉植物初生構造。隨著維管束組織的成熟，根狀莖不再伸長，而慢慢膨大，基本分生組織分化為成熟的薄壁組織，為貯存養分主要器官[10]。在白及由原球莖發育為假鱗莖的過程中，養分的積累量也發生著變化，其中原球莖和假鱗莖由于細胞不斷分裂分化，薄壁細胞中貯存了大量的養分，而根狀莖則因為不斷的發育生長，薄壁組織不成熟而養分較少[17]。

實驗觀察發現，組織培養條件下不定芽的分化與室外栽培條件下的分化略有不同，白及種子經過組織培養，大致4～5個月即可形成球形假鱗莖，通過外加激素的作用，假鱗莖可分化出多個不定芽，而此時母體也在不斷生長。這些不定芽在發育成完整小苗時，基部會分化出不定根，從而與母體形成徹底的生理隔離。而在室外栽培條件下，成熟白及只有在當年地上部分枯萎后，其地下假鱗莖才會萌發出不定芽，且此時假鱗莖具有明顯分叉。

43有關白及種子發育途徑的討論

作者在進行種胚發育進程實驗時，發現種子在不含激素和含激素NAA（05～10 mg·L-1）培養基上，種子萌發成苗的形態有較大的不同。當僅在1/2MS培養基上生長時，小苗（子葉分化完全）基部膨大的球體呈綠色；而當培養基中添加NAA（05～10 mg·L-1）時，膨大小球體為白色透明狀，該小球體在發育過程中也會不斷產生白色絨毛狀“假根”。張燕[18]、崔瑞勤[19]等研究認為白及萌發可經過原球莖和根狀莖2個途徑發育成苗，不同的培養基上發育途徑可能不一致。細胞組織學觀察發現，根狀莖的形成建立于內部維管束組織的分化[1617]，但胚性細胞團是否可直接分化形成維管束還有待進一步的研究。

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[責任編輯呂冬梅]