上皮間質轉化在宮頸癌侵襲和轉移中的作用研究

巴彩霞 郭佳 白雪峰

[摘要] 目的 探討上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）對宮頸癌侵襲和轉移的影響。 方法 對33例宮頸浸潤癌組織和23例宮頸原位癌組織（對照組）采用免疫組化方法進行EMT標志物的檢測。 結果 ①免疫組化檢測顯示56例宮頸癌組織中，發生浸潤及淋巴結轉移后，E-cadherin/β-catenin復合物的表達顯著低于原位癌組織（P<0.05），而Vimentin的表達顯著高于原位癌組織（P<0.05）。②浸潤性宮頸癌組織中Fibronectin及N-cadherin表達與組織學分級密切相關。③FN的表達與癌組織的浸潤深度相關。 結論 宮頸癌的侵襲轉移過程中存在著EMT現象，可以為宮頸癌的靶向治療提供理論依據。

[關鍵詞] EMT；宮頸癌；轉移；免疫組化

[中圖分類號] R737.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）09-0005-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of EMT on the invasion and metastasis of cervical cancer. Methods Immunohistochemistry was use to detectded the expression of markers of EMT in 33 cases of invasive cervical cancer and 23 cases of cervical carcinoma in situ （control group）. Results ①Expression of E-cadherin/β-catenin in invasive carcinoma and lymph node metastasis group was lower than carcinoma in situ（P<0.05）， and expression of Vimentin in invasive carcinoma and lymph node metastasis group was higher than carcinoma in situ（P<0.05）. ②The expression of FN and N-cadherin had relations with histological grade in Invasive cervical cancer. ③The expression of FN had relations with invasive depth of carcinoma. Conclusion Invasion and metastasis of cervical cancer exists phenomenon of EMT， which may provide a theoretic basis for the targeted treatment of cervical cancer.

[Key words] EMT； Cervical cancer； Metastasis； Immunohistochemistry

上皮細胞向間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是哺乳動物胚胎發育過程中的生理現象，但不適當的EMT使上皮性癌細胞獲得遷移侵襲的能力，影響著多種惡性腫瘤的進展[1，2]。目前宮頸癌細胞如何獲得入侵周圍組織的能力依然未知，但普遍認為EMT發揮了重要的作用。一些分子表型表達情況與EMT過程密切相關，被認為是EMT的標志物[3，4]。本研究檢測EMT相關標志物上皮性鈣黏附蛋白（E-cadherin）、β-鏈蛋白（β-catenin）、神經性鈣粘蛋白（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin，FN）及波形蛋白（Vimentin）在宮頸癌中的表達情況，探討EMT在宮頸癌侵襲轉移中的作用，為宮頸癌的治療和預后預測提供新的有價值的實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集我院2013年6月～2015年6月經病理檢查明確診斷的宮頸鱗癌標本56例（原位癌23例，浸潤癌33例），患者年齡31～67歲，平均48歲。宮頸鱗癌患者在術前均未接受任何放療、化療和生物治療，并有完整的臨床資料、病理診斷及隨訪資料。

1.2 方法

手術標本經中性甲醛固定，石蠟包埋，4.5 μm厚切片，HE和免疫組化染色。免疫組化采用高壓MaxVision法。標記一抗包括E-cadherin、β-catenin、N-cadherin、Fibronectin及Vimentin。所用免疫組化相關試劑購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3 免疫組織化學結果判定

采用雙盲法閱片。①E-cadherin和β-catenin免疫組化陽性物質呈棕褐色，主要定位于細胞膜。>90%癌細胞細胞膜陽性為高表達，<10%癌細胞細胞膜陽性為無表達。②N-cadherin免疫組化陽性物質主要定位于細胞膜，Vimentin及Fibronectin免疫組化陽性物質主要定位于細胞質。N-cadherin及Vimentin的判斷標準參照Nakajima S等的方法：≥20%癌細胞陽性為陽性表達；<20%癌細胞陽性為陰性表達。Fibronectin正常時癌細胞不表達，發生EMT時癌細胞胞漿表達。

1.4 統計學處理

應用SPSS15.0統計學軟件進行數據分析，組間陽性率比較采用χ2檢驗，以α=0.05為檢驗標準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 E-cadherin/β-catenin復合物及Vimentin在宮頸癌中的表達

56例宮頸癌中，23例原位癌E-cadherin/β-catenin復合物表達率為37.80%（圖1、2），20例浸潤癌無淋巴轉移E-cadherin/β-catenin復合物表達率為10.00%，13例浸潤癌有淋巴轉移患者E-cadherin/β-catenin復合物表達率為7.69%（表1）。組間差異有統計學意義（χ2=6.79，P<0.05）。發生浸潤及淋巴結轉移后，E-cadherin/β-catenin表達下調。此外，在淋巴轉移中存在個別病例E-cadherin和β-catenin表達均缺失，而在無淋巴轉移時并未發現二者同時不表達的情況。

浸潤癌淋巴結轉移組Vimentin陽性率為53.80%（圖3），浸潤癌無淋巴轉移Vimentin陽性率為40.00%，而原位癌Vimentin陽性表達率僅為13.00%，差異有統計學意義（χ2=7.23，P<0.05），說明宮頸癌在發生浸潤及淋巴結轉移時，Vimentin的表達上調（表1）。在原位癌和無淋巴轉移時，個別病例Vimentin存在陽性表達，但僅為弱陽性或局灶陽性。

2.2 FN及N-cadherin與宮頸浸潤癌臨床病理特征的關系

在宮頸浸潤癌中，FN及N-cadherin表達與組織學分級密切相關（圖4、5）（χ2=6.75、8.85，P<0.05），此外FN的表達與癌組織的浸潤深度相關（χ2=5.94，P<0.05）（表2）；而五種EMT標志物與宮頸癌的早期浸潤及局部侵襲（頸管累犯）無明顯相關性（P>0.05）。

3 討論

腫瘤細胞發生EMT后，侵襲能力明顯增強[1]。體外實驗證實許多腫瘤細胞系發生了部分或完全的EMT，瘤細胞失去了上皮細胞大部分的特征，而一些間葉來源細胞表型重新表達或高表達。相比于上皮細胞，間質細胞不存在完整的細胞層結構，呈纖維樣改變，但具有很強的移動性和可塑性，能夠離開原發灶，入侵和轉移至其他組織及器官。

E-cadherin屬于Ⅰ型鈣粘著蛋白，只表達于上皮細胞[5]。β-catenin是細胞粘附連接的組成成分，其與受體蛋白α-catenin相連后綁定于E-cadherin胞內區域，形成E-cadherin-β-catenin-α-catenin復合體，與肌動蛋白細胞骨架連接。因此，E-cadherin/β-catenin復合物是構建和維持細胞間聯系的核心力量。其缺失將導致細胞間粘附力下降而促使癌細胞的侵襲能力提升[6-9]，轉染E-cadherin cDNA到浸潤性癌細胞里可抑制其轉移能力。我們發現宮頸癌發生浸潤及淋巴結轉移后，E-cadherin/β-catenin復合物表達下調，并且有個別病例E-cadherin和β-catenin表達同時缺失。Vimentin是一種重要的Ⅲ型中間絲蛋白，廣泛存在于間質細胞及中胚層來源的細胞中，與癌細胞的粘附侵襲相關[8，10，11]。發生淋巴結轉移的宮頸癌，vimentin表達上調，陽性率達53.80%。這些細胞表型的變化意味著細胞間粘附力下降，極性丟失。

EMT與E-cadherin表達下調相伴隨的是產生N-cadherin，稱為鈣粘蛋白的轉換，其主要表達于間葉細胞[12-15]，與多種腫瘤的惡性程度、浸潤及轉移密切相關。我們發現N-cadherin與宮頸浸潤癌的病理組織學分級正相關，Ⅲ級時陽性率最高。此外，另一種標志物FN屬多粘附基質蛋白，可作為腫瘤組織分化程度低、侵襲性強、易于復發的判斷指標。FN的表達與宮頸癌的浸潤深度及組織學分級正相關，癌組織浸潤越深，細胞分化越差時，FN陽性表達越高。

此外，實驗發現宮頸原位癌早期浸潤和浸潤癌局部侵襲頸管與五種EMT標志物沒有顯著的相關性，我們認為可能是在宮頸癌早期和局部的發展中，沒有大量觸發EMT的因子，癌細胞沒有發生明顯的EMT過程，宮頸癌EMT在何時何處發生，受哪些因子激發和調控將是今后研究的一個有意義的方向。

目前，宮頸癌細胞EMT的機制成為研究的熱點，一些關鍵轉錄因子被發現及報道。鋅指轉錄因子Snail家族在宮頸癌EMT發生的過程中起著重要的作用[16，17]。Snail能夠抑制緊密連接蛋白、閉合蛋白及血栓調節蛋白的表達，更是重要的E-cadherin轉錄抑制因子[17]，并和宮頸癌淋巴結轉移密切相關[16]。E和結合鋅指蛋白（Zeb1/2）可下調E-cadherin的表達，Zeb1可誘導vimentin表達上調[18]。其表達與宮頸癌的侵襲性、盆腔淋巴結轉移、臨床分期呈正相關[19]。另已發現Twist是一種在EMT過程中居于重要地位的基本螺旋-環-螺旋（basichelix-loop-hlix，bHLH）轉錄因子，抑制E-cadherin的表達[17]。Twist1的高表達預示宮頸癌的預后及放化療抵抗[20]；Twist2的表達則可預測宮頸鱗狀細胞癌的轉移潛力[17]。

此外，Hsu等[21]發現第三型鉀氯協同轉運蛋白（KCC-3）參與宮頸癌EMT的發生，過度表達KCC-3的癌細胞呈現出EMT發生時的特征。阻斷KCC-3后癌細胞在細胞連接間E-cadherin and β-catenin的生成大量增加。KCC-3可抑制E-cadherin基因的轉錄和加速β-catenin蛋白的降解。在宮頸癌手術標本中，腫瘤組織KKC-3表達水平與癌細胞增殖范圍密切相關。表皮生長因子（EGFR）也可促使宮頸癌細胞發生相似的改變[22]。正常宮頸上皮細胞極少表達EGFR，EMT中的細胞形態和分子標志不受EGFR刺激的影響。臨床手術標本證實宮頸癌細胞EGFR過度表達與E-cadherin/β-catenin低表達伴隨發生。

綜上所述，宮頸癌的侵襲轉移過程中存在著EMT現象。癌細胞發生EMT后，細胞表型發生變化，侵襲轉移能力增強。然而，宮頸癌EMT體外實驗面臨著諸多限制，幾乎沒有正常的癌細胞能夠經歷完整的EMT過程，究其原因可能是EMT對培養環境非常敏感。在活體內，EMT的分子機制仍然沒有得到全面完整的分析。但是隨著實驗條件的完善，EMT過程及發生機制的研究將逐漸深入，最終能夠為宮頸癌靶向藥物的研制及臨床治療提供可靠的依據。

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（收稿日期：2016-01-25）