超高效液相色譜-串聯質譜法測定橡膠產品中4種秋蘭姆類硫化促進劑含量

榮杰峰，毛樹祿，鐘堅海，李軍法，黃秋蘭，

鄒　強1，張元金1，陳學燦1

(1.泉州出入境檢驗檢疫局，福建　泉州　362000；2.龍巖出入境檢驗檢疫局，福建　龍巖　364000)

超高效液相色譜-串聯質譜法測定橡膠產品中4種秋蘭姆類硫化促進劑含量

榮杰峰1*，毛樹祿1，鐘堅海2，李軍法1，黃秋蘭1，

鄒強1，張元金1，陳學燦1

(1.泉州出入境檢驗檢疫局，福建泉州362000；2.龍巖出入境檢驗檢疫局，福建龍巖364000)

摘要：建立了橡膠產品中4種秋蘭姆類硫化促進劑(二硫化四芐基秋蘭姆(TBZTD)、二硫化二甲基二苯基秋蘭姆(TMD)、福美雙-D12(Thiram D12)、二環戊亞甲基二硫化秋蘭姆(DPTD))的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。橡膠材料中的硫化促進劑經甲醇超聲多次提取，提取液離心過濾后以反相C18色譜柱為分離柱,甲醇和水作為流動相進行洗脫，經超高效液相色譜-串聯質譜儀測定，外標法定量。研究了不同色譜條件下目標物質的分離情況和不同提取溶劑對提取凈化效率的影響。在最優化條件下，TMD和Thiram D12在0.002～1.000 mg/L濃度范圍內線性關系良好，其定量下限分別為0.001 0 mg/L和0.001 2 mg/L；TBZTD在0.100～10.000 mg/L濃度范圍內線性關系良好，定量下限為0.100 0 mg/L；DPTD在0.020～10.000 mg/L濃度范圍內線性關系良好，定量下限為0.020 0 mg/L。空白樣品在不同濃度水平的平均加標回收率為82.7%～98.8%，相對標準偏差(RSD)為4.6%～7.0%。該方法簡便、快速、靈敏，可滿足橡膠產品中TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD的測試要求。

關鍵詞：秋蘭姆；硫化促進劑；橡膠產品；超高效液相色譜-串聯質譜法；檢測

硫化促進劑是橡塑材料硫化工業中不可或缺的物質，被廣泛用于鞋材橡塑制品中；秋蘭姆類硫化促進劑是硫化促進劑中非常重要的一類，包括一硫化秋蘭姆、二硫化秋蘭姆和多硫化秋蘭姆。近年來，隨著秋蘭姆類硫化促進劑的廣泛使用，其危害性也逐漸被人們發現和關注。秋蘭姆類物質可作為殺菌劑或殺蟲劑應用于農藥生產，其本身對人體具有急性毒性,隨著對化學品毒理實驗和MSDS評估認證報告的不斷完善，越來越多的秋蘭姆類硫化促進劑被證明對人體或環境有著更多的潛在危害。研究表明，秋蘭姆在橡膠硫化過程中可生成致癌的亞硝胺；秋蘭姆類促進劑能引起動物的肺、心和其它器官嚴重變形，并可經呼吸道、消化道及皮膚吸收進入生物體內，危害人類健康。秋蘭姆類硫化促進劑是一類重要的過敏源，人體接觸含有秋蘭姆類硫化促進劑的橡膠制品會造成皮膚過敏[1-5]。我國對橡膠促進劑目前沒有明確的標準要求，但鑒于橡膠及其制品直接與皮膚接觸較多，所以很有必要對橡膠及其制品中的秋蘭姆類硫化促進劑進行有效的檢測與監控，以適應國內外安全需求，保障使用人員身體健康，促進進出口貿易的順利進行。

圖1　4種秋蘭姆類硫化促進劑的分子結構式Fig.1　Molecular structures of four vulcanization accelerators

目前橡塑產品中秋蘭姆類硫化促進劑的檢測方法少有報道，農業上常用作殺菌劑、殺蟲劑和除草劑的秋蘭姆類和二硫代氨基甲酸酯(鹽)類農藥的檢測方法報道較多，相應的檢測方法主要是基于Keppel在1969年提出的二硫代氨基甲酸酯酸水解法。該法基于二硫代氨基甲酸酯在SnCl2存在的酸性水溶液中水解釋放CS2，繼而用氣相色譜法[6-7]、氣相色譜-質譜法[8]等進行檢測。這些方法具有靈敏度高、分析時間短等優點，但不能分別測定各種二硫代氨基甲酸酯的含量，且易出現假陽性結果。其它不經水解而測定二硫代氨基甲酸酯的方法有氣相色譜法[9]等。近年來，液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術得到快速發展，已越來越多地被應用于食品和環境中二硫代氨基甲酸酯含量的檢測[10-15]。目前橡膠產品中秋蘭姆類硫化促進劑的檢測方法尚缺乏研究，無相關檢測方法和標準的報道。本文首次建立了橡膠產品中4種秋蘭姆類硫化促進劑二硫化四芐基秋蘭姆(TBZTD)、二硫化二甲基二苯基秋蘭姆(TMD)、福美雙-D12(Thiram D12)、二環戊亞甲基二硫化秋蘭姆(DPTD)同時檢測的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，能單獨對各種秋蘭姆類硫化促進劑進行定性和定量分析。4種硫化促進劑的結構式如圖1所示。其中TBZTD具有分子量大、熔點高、分解難的特性，主要用來取代易產生致癌亞硝胺的秋蘭姆類促進劑二硫化四甲基秋蘭姆和二硫化四乙基秋蘭姆，以減少有致癌嫌疑的亞硝胺的存在。TMD是天然橡膠、合成橡膠的硫化促進劑，可用于高硫、低硫或無硫等硫化體系；其既可作促進劑，又可作硫化劑，也可作二硫化四甲基秋蘭姆、一硫化四甲基秋蘭姆和二硫代氨基甲酸鋅的第二促進劑。Thiram D12是福美雙的氘代同位素化合物；福美雙可以治療疫病等菌類感染疾病，廣泛用作植物殺菌劑和橡膠工業中的促進劑。DPTD同樣被廣泛用作橡膠工業中的促進劑。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AB SCIEX(Distribution) 3500型超高效液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀；KQ-500E型數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器公司)，超聲頻率40 kHz，超聲電功率500 W，溫度40 ℃；管狀硬質玻璃瓶，40 mL，帶旋蓋(有聚四氟乙烯墊片)。

二硫化四芐基秋蘭姆(無純度)、二硫化二甲基二苯基秋蘭姆(含量>97.0%)、二環戊亞甲基二硫化秋蘭姆(含量>99.0%)均購自上海安譜實驗科技股份有限公司，福美雙-D12(含量99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH)；乙腈、甲醇、丙酮(色譜純，美國M-Tedia公司)；乙酸銨、甲酸(HPLC級，美國 ROE Scientific INC)；實驗用水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2標準溶液的配制

標準儲備溶液：分別稱取適量的TBZTD,TMD,Thiram D12和DPTD標準物質，用甲醇稀釋定容得濃度為100 mg/L的標準儲備溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

混合標準工作液：各取一定體積的上述4種標準儲備液，用甲醇稀釋，配成質量濃度在0.002～10.000 mg/L范圍的系列混合標準工作液，現配現用。

基質標準工作溶液：各取一定體積的上述4種標準儲備液，用不含上述4種硫化促進劑的提取液稀釋得質量濃度在0.002 ～10.000 mg/L范圍的系列基質標準工作溶液，現配現用。

1.3樣品前處理

提取：準確稱取1 mm×1 mm以下橡膠產品樣品1.00 g，置于管狀硬質玻璃瓶中，加入15 mL甲醇，超聲提取20 min，過濾并收集提取液；樣品中再次加入10 mL甲醇，超聲提取20 min，過濾，合并濾液轉移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度；取上層溶液過0.22 μm有機濾膜后上UPLC-MS/MS，以峰面積外標法定量。

1.4色譜-質譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18反相液相色譜柱(2.1 mm×100 mm，粒徑1.7 μm)；流動相為甲醇-水(9∶1)溶液，流速為0.30 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描模式，掃描時間：100 ms；離子源溫度：550 ℃，氣簾氣：25 psi；碰撞氣：7 psi；毛細管電壓：5 500 V；離子源氣體1：55 psi；離子源氣體2：55 psi。

2結果與討論

2.1質譜條件的優化

分別取0.5 mg/L的4種硫化促進劑標準溶液，以5 μL/min的流速分別注入到離子源，在ESI+和ESI-離子化模式下分別進行全掃描，以選擇適當的電離方式和準分子離子峰。實驗結果表明，TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD均更適合在ESI+離子化模式下檢測，在ESI+模式下分別對其進行一級質譜掃描(Q1掃描)得到分子離子峰[M+H]+，再對其分子離子進行二級質譜分析(子離子掃描)，得到碎片的離子信息。通過優化二級質譜參數使特征碎片離子的強度達到最佳狀態，根據各化合物的二級質譜圖，選擇TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD的定量離子對分別為m/z546.2/239.9，m/z365.2/149.9，m/z253.2/125.5，m/z320.8/128.1。 確定定量、定性離子對后，再對去簇電壓及碰撞氣能量等參數進行優化，使得分子離子和特征碎片離子強度達到最大，優化后的質譜條件見表1。

表1　4種硫化促進劑的質譜參數

2.2液相色譜條件的優化

分別考察了甲醇-水(9∶1)、甲醇-鹽水溶液(5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸水溶液)(9∶1)、乙腈-水(9∶1)、乙腈-鹽水溶液(5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸水溶液)(9∶1) 4種流動相對1 mg/L的TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD混合標準溶液出峰情況的影響。結果表明：采用甲醇-水為流動相時，4種物質的響應均明顯優于乙腈-水為流動相時的響應，而采用甲醇-水和采用甲醇-鹽水溶液為流動相時的響應相近，采用乙腈-水和采用乙腈-鹽水溶液為流動相時的響應相近。此外，采用乙腈-水時的出峰時間相對于采用甲醇-水為流動相時稍微提前，其中TBZTD的保留時間由4.26 min前移至2.69 min，其它3種促進劑的保留時間稍有提前。以上4種流動相條件下，TMD和DPTD的保留時間基本相同，從TIC圖上無法分辨，但兩者的定量離子對和定性離子對均不同，所以可以通過不同的離子對來進行區分；由于采用鹽水溶液(5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸水溶液)對檢測對象的響應無明顯改善，所以實驗最終選擇甲醇-水作為流動相。

實驗對流速及甲醇-水流動相的比例進行了考察，結果表明，當流速增加時，峰形變窄、對稱。隨著甲醇含量的增加，4種硫化促進劑色譜峰的保留時間變短，峰形更窄，由于TMD和DPTD的極性相近，即使增加水相含量，仍然無法使得這幾種物質達到完好分離；但使用二級質譜可以很好地分辨出這幾種物質。當流動相甲醇和水的比例為9∶1，流速為0.3 mL/min時，TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD的分離效果較好，峰形較好，保留時間依次為4.26，1.68，1.36，1.65 min，實驗最終選擇在該條件下進行。

2.3提取條件的優化

這4種硫化促進劑均含有雙巰基結構，均屬較強極性有機化合物，不宜用乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等中等極性或弱極性有機溶劑提取。采用超聲波輔助萃取，考察了甲醇和乙腈兩種提取溶劑對硫化橡膠中TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD的提取效率：準確稱取1.00 g(1 mm×1 mm)以下陽性樣品，加入15 mL提取溶劑，超聲提取20 min，提取液用0.22 μm濾膜過濾，上機測試；隨后樣品中加入10 mL提取溶劑，按照上述步驟超聲20 min，過濾，上機測試；再次于樣品中加入10 mL提取液，超聲，過濾，上機測試，平行測定3次。對兩種溶劑3次提取的實驗結果進行考察。

結果顯示，甲醇第1次的提取效率略高于乙腈，且兩種溶劑均無法一次將目標化合物完全提??；提取兩次后，兩種溶劑對TBZTD，TMD，Thiram D12和DPTD的提取效率均可達99%以上。為使流動相和樣液一致，最終選擇甲醇作為提取溶劑，提取兩次，第1次用量15 mL，第2次用量10 mL，合并提取液，定容至25 mL。

2.4線性關系、定量下限及方法的定量下限

選用不含目標硫化促進劑的橡膠樣品為基質，按照“1.3”方法進行前處理得空白基質溶液，以該基質溶液為溶劑稀釋配制濃度為0.1，0.5，2.0 mg/L的基質混合標準溶液，結果顯示4種硫化促進劑基質加標溶液的響應僅相當于標準溶液的30%～50%左右，說明基質效應較明顯。為了獲得較好的回收率和更準確的檢測，實驗采用基質標準工作曲線進行定量分析，在樣品加標回收實驗中獲得較好的效果。選用不含目標化合物的橡膠樣品為基質，按照“1.3”方法前處理后得空白基質溶液，用空白基質溶液逐級稀釋標準儲備液，配成濃度分別為0.002，0.020，0.100，0.500，1.000，10.000 mg/L的混合基質標準工作溶液。按照上述最優化色譜-質譜條件對基質標準工作溶液進行檢測，以各種硫化促進劑的質量濃度(X，mg/L)為橫坐標，以對應的峰面積(Y)為縱坐標，繪制基質標準工作曲線，其中TMD和Thiram D12在0.002～1.000 mg/L，TBZTD在0.100～10.000 mg/L，DPTD在0.020～10.000 mg/L濃度范圍內響應線性良好；在不含目標組分的橡膠樣品中添加適量的混合標準工作溶液后，按照“1.3”方法進行處理后上機，以10倍信噪比(S/N=10)確定各硫化促進劑的儀器定量下限(LOQ)，以1.00 g樣品提取最終定容至25 mL計算方法的定量下限，相關參數見表2，其中TMD和Thiram D12獲得了較好的靈敏度和較低的定量下限；而TBZTD和DPTD的響應和靈敏度稍差。

表2　方法的回歸方程、相關系數、線性范圍、儀器定量下限、方法定量下限

表3　方法的平均回收率和相對標準偏差

2.5回收率與精密度

選用不含目標化合物的橡膠樣品為基質，按照檢出限選擇加入濃度不同的4種硫化促進劑標準溶液，按最優化的方法進行前處理后上機，平行測定5次，基質標準曲線外標法定量，獲得相應的回收率和相對標準偏差(見表3)。結果表明，4種硫化促進劑的平均回收率為82.7%～98.8%，相對標準偏差(RSD)為4.6%～7.0%。

圖2　實際樣品的TIC譜圖Fig.2　TIC chromatogram of a practical sample

2.6實際樣品的檢測

應用本方法對20個橡膠產品進行檢測，其中5個樣品檢出TBZTD，含量為2.35～8.47 mg/kg；2個樣品檢出TMD，含量為2.75～4.26 mg/kg；1個樣品檢出DPTD，含量為7.08 mg/kg。某一實際樣品的TIC譜圖見圖2。結果表明TBZTD作為一種環保型硫化促進劑被廣泛使用；TMD和DPTD的存在說明其使用較為普遍，所以加強相關硫化促進劑檢測方法的建立對于保障使用人員身體健康，推動相關行業健康發展有重要意義。

3結論

本文首次建立了橡膠產品中4種秋蘭姆類硫化促進劑TBZTD，TMD，Thiram D12,DPTD的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法，研究了不同色譜條件下目標物質的分離情況和橡膠中秋蘭姆類硫化促進劑的提取方法。該方法簡便、快速、靈敏，可滿足橡膠產品中TBZTD，TMD，Thiram D12,DPTD的測定要求。從實際樣品的檢測情況看，開展相關硫化促進劑的檢測方法研究對于適應國內外安全需求，保障使用人員身體健康，確保相關行業的健康發展和推動相應法律法規的建立具有非常積極的意義。

參考文獻：

[1]Uter W,Hegewald J,Pfahlberg A,Lessmann H,Schnuch A,Gefeller O.Int.Arch.Occup.Environ.Health,2010,83(6):675-681.

[2]Dikland H,Cheng B J.AutomobileTechnol.Mater.,2005,5:30-33.

[3]Prasad M H ,Pushpavathi K,Reddy P P.Environ.Res.,1986,40(1):199-201.

[4]Brehler R,Rütter A,Kütting B.ContactDermatitis,2002,46:65-71.

[5]Wrangsj? K,Mellstrüm G,Axelsson G.ContactDermatitis,1986,15(2):79-84.

[6]Vryzas Z,Papadakis E N,Euphemia P M,J.Agric.FoodChem.,2002,50(8):2220-2226.

[7]Xu Y C，Zhu J L，Zhang Y，Hou Z G，Song Y Y.J.JilinAgric.Univ.(許允成，朱杰麗，張宇，侯志廣，宋艷宇.吉林農業大學學報)，2004，26(2)：197-181.

[8]Kawamoto T,Yano M,Makihata N.J.Chromatogr.A,2005,1074:155-161.

[9]Hu X Q，Li Z，Wu M，Li K，Cang T.ActaAgric.Zhejiangensis(胡秀卿，李振，吳珉，李康，蒼濤.浙江農業學報)，2004，16(5)：282-285.

[10]Hayama T,Yadaa K,Onimarua S,Yoshidab H,Todorokib K,Nohtab H,Yamaguchib M.J.Chromatogr.A,2007，1141:251-258.

[11]Hayama T,Takada M.Anal.Bioanal.Chem.,2008,392(5):969-976.

[12]Zhu W X，Yang J Z，Liu Y F，Wei W.J.Instrum.Anal.(祝偉霞，楊冀州，劉亞風，魏蔚.分析測試學報)，2010，29(11)：1109-1113.

[13]Chen L P，Li J X，Wu M，Lin L Y，Chen D J，Zhou Y，Xu D M.J.Instrum.Anal.(陳鷺平，李久興，吳敏，林立毅，陳達捷，周昱，徐敦明.分析測試學報)，2013，32(3)：287-292.

[14]Shen J C，Xie L Q，Xiao L L，Jin B H，Ye G，Xiao C G.Chin.J.Anal.Chem.(沈金燦，謝麗琪，肖來龍，靳寶輝，葉剛，肖陳貴.分析化學)，2009，37(12)：1795-1799.

[15]Crnogorac G,Schwack W.RapidCommun.MassSpectrom.,2007,21(24):4009-4016.

Determination of 4 Thiurams Vulcanization Accelerators in Rubber Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

RONG Jie-feng1*，MAO Shu-lu1，ZHONG Jian-hai2，LI Jun-fa1，HUANG Qiu-lan1，ZOU Qiang1，ZHANG Yuan-jin1，CHEN Xue-can1

(1.Quanzhou Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Quanzhou362000，China；2.Longyan Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau,Longyan364000，China)

Abstract：A rapid method was developed for the determnation of 4 thiurams vulcanization accelerators,tetrabenzyl thiuram disulfide(TBZTD),dimethyldiphenylthiuram disulfide(TMD),thiram D12 and dicyclopentamethylenethiuram disulfide(DPTD) in rubber products by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).Rubber samples were diluted in methanol and extracted by ultrasonic.After centrifugation and filtration,the target compounds were separated on a reversed-phase C18column with a mixture of methanol and water as mobile phase,analyzed by UPLC-MS/MS and quantified by the external standard method.Separation of the target substances in different chromatographic conditions was investigated,and effects of different extraction solvents on extraction effienciency were investigated.Under the optimal conditions,the calibration curves for TMD,thiram D12,TBZTD and DPTD were in good linearity in the ranges of 0.002-1.000,0.002-1.000,0.100-10.000, 0.020-10.000 mg/L,respectively,with limits of quantitation of 0.001 0,0.001 2,0.100 0,0.020 0 mg/L,respectively.Recovery tests were made by the addition of standards to blank sample at different concentrations,and the recoveries were in the range of 82.7%-98.8% with relative standard deviations(RSDs,n=5) of 4.6%-7.0%.The method is simple,rapid and sensitive,and could meet the requirements for detection of TBZTD,TMD,Thiram D12 and DPTD in rubber products.

Key words：thiuram;vulcanization accelerator;rubber products;ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS);detection

收稿日期：2015-10-15；修回日期：2015-11-03

基金項目：國家質檢總局科研項目(2014IK182)

*通訊作者：榮杰峰，工程師，研究方向：輕工產品及食品檢測，Tel：0595-68292691，E-mail：jfrong2010@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.011

中圖分類號：O657.63；TQ314.243

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0438-05