急性心肌梗死患者壞死心肌組織自噬相關基因表達及意義

王韋，張政(上海市青浦區中山醫院青浦分院，上海201700)

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急性心肌梗死患者壞死心肌組織自噬相關基因表達及意義

王韋，張政(上海市青浦區中山醫院青浦分院，上海201700)

摘要：目的觀察急性心肌梗死(AMI)患者壞死心肌組織自噬相關基因Beclin1、微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表達，探討其意義。方法選取行冠狀動脈介入治療的AMI患者50例，取其壞死心肌組織為觀察組；疑似心源性疾病患者20例，取其正常心肌組織為對照組。采用Real-time PCR和Western blotting法分別檢測兩組自噬相關基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表達，分析各基因相對表達量與AMI患者年齡、性別、心功能分級的關系。結果觀察組心肌組織自噬相關基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白的相對表達量均較對照組升高(P<0.05或<0.01)；隨心功能分級增加，上述基因的表達量逐漸升高，隨年齡增長表達量逐漸降低。結論AMI患者壞死心肌組織自噬相關基因表達升高，心肌細胞自噬可能參與AMI的發生、發展。

關鍵詞：急性心肌梗死；自噬；自噬相關基因；Beclin 1；微管相關蛋白1

急性心肌梗死(AMI)是心臟病患者致死、致殘的主要病因[1,2]，近年來其發病率逐年上升。自噬是一種廣泛存在于真核細胞的細胞死亡方式，參與心臟疾病的發生、發展[3]。目前，關于AMI患者是否存在心肌細胞自噬及自噬對病情影響的報道較少。本研究觀察AMI患者壞死心肌組織自噬相關基因Beclin 1、微管相關蛋白1輕鏈3( LC3)-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及蛋白表達，并探討其意義。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2009年9月～2012年8月上海市青浦區中山醫院青浦分院診治的AMI患者50例，均符合《中華醫學會心血管病學分會2001年急性心肌梗死診斷和治療指南》的診斷標準[4]，其中男27例，女23例；年齡35～72(51.3±5.8)歲，<41歲4例、41～50歲16例、51～60歲19例、≥61歲11例；心功能Ⅰ級8例，Ⅱ級11例，Ⅲ級22例，Ⅳ級9例；排除生命體征不穩定，心源性休克、先天性心臟病及心肌病等心血管病變，凝血功能障礙，肝、腎等全身其他臟器衰竭，嚴重感染，糖尿病、低血壓、高血壓和貧血患者。從癥狀發生到住院時間均在1周以內；均行冠狀動脈介入(PCI)術及常規藥物治療。PCI術中均留取壞死心肌組織作為觀察組。選取本院疑似心源性疾病患者20例，均經心內膜取心肌組織活檢，經鏡下檢查未見心肌組織病理改變，即正常心肌組織，作為對照組。

1.2心肌組織Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA檢測采用實時定量PCR法。將心肌組織剪碎置于組織研磨缽中，采用TRIzol法提取總RNA，DNase I消化、酚/氯仿抽提及異丙醇沉淀純化RNA，按照RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0反轉錄試劑盒說明書操作獲得mRNA，根據SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus)試劑盒操作說明書配制熒光定量PCR反應體系，于熒光定量PCR儀進行PCR擴增，根據2-ΔΔCt方法計算Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA的相對表達量。分析各基因相對表達量與AMI患者年齡、性別、心功能分級的關系。Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和β-actin基因引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成[5]。

1.3心肌組織Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白檢測采用Western blotting法。采用含有0.1% PMSF的預冷生理鹽水沖洗心肌組織，加入400 μL RIPA裂解液于組織研磨器上研磨，冰上靜置30 min，4 ℃環境下10 000 r/min離心30 min，取上清液，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。取100 μg蛋白加入4×SDS-PAGE Loading buffer沸水中孵育10 min，進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后切下目的蛋白凝膠于轉膜儀上轉膜，轉膜后的膜用含有5%脫脂奶粉的TBST液封閉，分別加入Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5和β-actin抗體孵育過夜，TBST液洗膜后加入二抗結合1 h，沖洗后利用ECL發光試劑盒顯影，于化學發光成像系統觀察、拍照，計算Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白的相對表達量。分析各基因相對表達量與AMI患者年齡、性別、心功能分級的關系。

2結果

2.1兩組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表達比較觀察組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA及LC3-Ⅱ mRNA/LC3-Ⅰ mRNA相對表達量均較對照組升高(P<0.05或<0.01)。見表1。觀察組不同年齡、性別和心功能分級者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA相對表達量比較見表2。

表1　兩組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5 mRNA表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

表2　觀察組不同年齡、性別和心功能分級者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA表達比較

注：與年齡<41歲者比較，*P<0.05，△P<0.01；與心功能分級Ⅰ級者比較，#P<0.05，▲P<0.01。

2.2兩組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Atg5蛋白表達比較觀察組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均高于對照組(P<0.01或<0.05)。見表3。觀察組不同年齡、性別和心功能分級者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 蛋白表達見表4。

表3　兩組Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05，△P<0.01。

表4　觀察組不同年齡、性別和心功能分級者Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表達比較

注：與年齡<41歲者比較，*P<0.05，△P<0.01；與心功能分級Ⅰ級者比較，#P<0.05，▲P<0.01。

3討論

自噬是存在于真核細胞生物體內的新陳代謝現象，是細胞的一種自我更新和自我防護機制。適度的自噬可保護細胞免受環境刺激的影響，而自噬過度或自噬缺陷則可導致疾病的發生[6～10]。心肌細胞自噬在許多心血管疾病的發生、發展過程中扮演重要角色[11]。心肌細胞是一種長壽命分裂后期細胞，屬于終末細胞，其分化再生能力較弱。Vacek等[12]報道，心肌細胞的長時間存活與自噬密切相關。在生理狀態下，心肌細胞自噬水平低，但在保障心臟功能和維持心肌活力方面具有重要作用。心肌細胞通過自噬作用降解錯誤折疊或功能異常的蛋白質，為心肌細胞提供能量、促進物質循環以維持正常心肌功能；同時自噬亦可清除受損或老化細胞的細胞器，使其不斷自我更新。研究證實，心肌缺血可引起心肌細胞營養不足，激發心肌細胞自噬；自噬可選擇性增加氧缺乏時ATP的生成以適應這種低營養狀態，從而發揮心臟保護作用[13]。通過調節和恢復細胞自噬為前瞻性的抗衰老策略，可改善或緩解多種年齡相關的退行性病變。

自噬的激活受到LC3、Atg和Beclin1等多種自噬相關基因的調控。Beclin1基因也稱BECN1基因，是哺乳動物最早發現的自噬基因之一，主要通過與PI3K形成復合體調節自噬活性[14]。當自噬發生時，Beclin1基因活性明顯上調。Beclin1能與分隔膜結合，通過募集Atg家族蛋白Atg12-Atg5-Atg16復合物形成前自噬泡。Atg是自噬發生過程中的特異性基因，在自噬的發生和調控過程中發揮重要作用。LC3是與自噬體形成相關的哺乳動物蛋白，LC3具有兩個亞型，即胞質型LC3-Ⅰ和膜型LC3-Ⅱ。在自噬泡形成過程中LC3發揮至關重要的作用，自噬激活時LC3前體加工成細胞質可溶性形式LC3-Ⅰ；隨后LC3-Ⅰ經酶解迅速成為膜結合形式LC3-Ⅱ并結合于前自噬體和自噬體，促進自噬體外膜的延展擴張；同時Atg12-Atg5-Atg16復合物脫落，形成成熟的自噬體。一旦與溶酶體融合，LC3-Ⅱ即被水解酶降解。

本研究結果顯示，觀察組自噬相關基因Beclin1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表達均顯著增高，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(定量反映細胞自噬活性的指標)也明顯高于對照組，說明AMI患者心肌細胞存在明顯自噬現象；此外，隨年齡增加，AMI患者心肌組織Beclinl、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ值均逐漸降低，與Taneike等[15]報道結果一致。自噬是真核細胞內的一種主要消化降解途徑，心肌缺血時自噬活性上升可以清除受損線粒體，增強蛋白質降解，但隨著年齡增加，心肌降解蛋白質能力下降，自噬水平降低。本研究中隨心功能分級增加，AMI患者心肌組織Beclinl、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Atg5 mRNA和蛋白表達及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均逐漸增高，可能是由于隨著梗死程度加劇，心肌細胞線粒體大量損傷，細胞中產生大量活性氧，增強自噬活性[10]，但其具體機制仍需進一步研究。

綜上所述，AMI患者壞死心肌組織自噬相關基因表達升高，心肌細胞自噬可能參與AMI的發生、發展。

參考文獻：

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(收稿日期：2015-12-15)

中圖分類號：R541.4

文獻標志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)12-0046-03

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.015

通信作者：張政(E-mail: qpwangwei@126.com)