新疆北疆地區戶用沼氣微生物群落多樣性分析

陳 競,代金平,楊新平,古麗·艾合買提，買爾哈巴，馮 蕾

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊　830091)

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新疆北疆地區戶用沼氣微生物群落多樣性分析

陳 競,代金平,楊新平,古麗·艾合買提，買爾哈巴，馮 蕾

(新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊830091)

摘要：【目的】從碳代謝的角度比較不同地區沼氣池微生物群落功能多樣性。【方法】以北疆戶用沼氣為研究對象，采用Biolog微平板技術，以DPS數據處理軟件解析來自北疆四個不同地區沼液微生物群落碳代謝多樣性。【結果】從平均顏色變化率(AWCD)看出，各組樣品間微生物活性差異顯著。多樣性分析顯示，水西溝組的Shannon指數較高。主成分分析顯示，各組沼液微生物群落碳源利用特征存在明顯差異，其中在PC1和PC2上起主要分異作用的碳源也各不相同。【結論】各組沼液微生物群落有很高的豐富度，并且存在明顯差異，但地域性差別不明顯。

關鍵詞:沼液；微生物多樣性；Biolog 生態板；碳代謝

0前 言

【研究意義】隨著新疆經濟的發展，大型規模化畜禽養殖場開始興起，與此同時畜禽糞便及屠宰下水的環境污染問題也日益突出，沼氣工程是養殖場廢棄物污染治理的最主要解決辦法[1-2]。通過發展沼氣工程，規模化養殖場不但可以解決污染，還能獲得有機肥和清潔能源，可謂一舉三得。要想使得沼氣裝置高效穩定運行，除了現代智能化的沼氣裝置，高活性的沼氣微生物種群，也是沼氣池穩定高效運行的關鍵[3]。新疆地區冬季寒冷漫長，沼氣池存在產氣率低、使用率低、原料分解率低、沼氣使用綜合效益差等問題，尤其是北疆氣溫偏低，全年≥10℃的天數為38～144 d，絕大部分為次沼氣適宜區和不適宜區[4]，因此了解北疆地區沼液微生物多樣性，為開展北疆地區沼氣產氣的優化工作奠定基礎。【前人研究進展】徐慶賢等[5]研究表明，沼氣池中微生物種類豐富，并且擁有優勢種群，主要有：穩桿菌屬、熱單細胞屬、杜檊氏菌屬、戈登氏菌屬、芽孢桿菌屬、擬桿菌門、類群和厭氧細菌門。各細菌種類不同發酵層、不同發酵時間對微生物多樣性存在影響。無論是傳統的分離純培養技術，還是PCR-DGG技術的應用都有其局限性[6-8]。針對沼液兼性厭氧微生物群落多樣性研究分析技術的相關報道很少。【本研究切入點】嘗試用Biolog微平板技術，從微生物群落碳代謝功能多樣性的角度，分析北疆地區沼液兼性厭氧微生物群落多樣性。【擬解決的關鍵問題】以北疆四個不同地區沼液樣品為材料，通過Biolog微平板培養和讀數，對不同地區沼氣池微生物群落多樣性進行分析，為實現沼氣發酵的進一步優化和可控運行打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 采集地基本情況

四組沼液樣品分別于2013年10月底采自塔城額敏、吐魯番、伊犁特克斯、水西溝。這些戶用沼氣池均屬國家惠民工程，額敏建在牧民安置小區，吐魯番和特克斯建在農戶庭院內沼氣示范工程，水西溝則建在溫室大棚內。列出采樣點基本信息。表1

表1 戶用沼氣基本情況
Table 1Household biogas basic situation

地區Region農戶Farmers規模Size(m3)室內/外Indoor/outdoor底物Substrate產氣情況Biogasstatus維護情況Maintenance額敏e115室外牛糞夏季正常無Emine215室外牛糞低無e315室外牛糞夏季正常無e415室外牛糞良好有吐魯番Tu110室外牛豬糞夏季正常有TurpanTu210室外牛豬糞停氣無Tu310室外牛豬糞夏季正常有Tu410室外牛豬糞停氣無Tu58室外牛豬糞夏季正常無特克斯TE115室內牛羊糞夏季正常有TekesTE210室內牛羊糞夏季正常無TE315室內牛羊糞低有TE415室外牛羊糞夏季正常無TE515室外牛羊糞低無TE615室外牛羊糞低無水西溝s110室內牛羊糞正常有Shuixigous210室內牛羊糞低無s310室內牛羊糞正常無

1.1.2 樣品采集

從戶用沼氣池出料口經攪拌均勻后于浮渣下層取沼液裝瓶，帶回實驗室4℃保存。用于Biolog 微生物群落功能多樣性分析。

1.1.3主要試劑和儀器

Biolog-ECO板(美國)，Biolog 微生物鑒定系統(美國)。

1.2方 法

1.2.1沼液微生物群落碳源代謝活性測定

參考Biolog -Eco 微平板法進行[9]。前三組沼液經充分混勻后，用滅菌的生理鹽水(0.89%)稀釋2 000倍，水西溝組稀釋500倍。分別吸取150 μL 菌懸液接種于生態板的每一個小孔，將接種好Biolog-ECO板放至的25℃的恒溫培養箱中培養，并每隔24 h于在Biolog 讀數儀上測量590 nm 波長下讀取吸光值，連續培養7 d。

1.2.2數據處理方法

微生物群落代謝活性強度采用平均顏色變化率(AWCD)來描述[10]:

AWCD= ∑(Ci-Ro)590/ 31

式中，Ci為每個有培養基孔的吸光值，Ro為對照孔的吸光值，31 為培養基孔數。

采用Simpson(D)、Shannon-Wiener(H’) 和McIntosh(U) 三個指數來表征土壤微生物群落功能多樣性。其計算公式如下:

Simpson(D) 指數D= 1-∑pi2

Shannon-Wiener(H’)指數

式中，s為物種總數，pi為第i種物種個體數占群落總個體數的比例。

Ni為抽樣中第i個物種的個體數量。

采用Microsoft Excel 2003，DPS 9.50 版軟件進行平均吸光值(AWCD) 、多樣性指數、主成分( PCA) 分析。

2結果與分析

2.1沼液微生物群落代謝平均顏色變化率

沼液微生物群落單一碳源代謝活性可由平均顏色變化率來直觀的反應，微生物群落代謝功能的變化與微生物群落結構相關[11]。平均顏色變化率( AWCD)是判斷土壤微生物群落利用碳源能力的重要指標之一，代表土壤微生物的代謝活性[12]。4組沼液樣品接種培養后每隔24 h 測定吸光值，消除原始菌濃影響后計算平均吸光值，連續7 d后，得到平均吸光值動態變化圖 。可以看出，由于樣品稀釋濃度較大，多數樣品在48 h后，碳源利用強度才開始上升。第1、2、3組樣品在培養7 d后，吸光值呈現較大差異，而第4組則趨于相似。曲線快速上升的時間基本都保持在48 h，之后增速放緩，只有第1組7 d后仍保持上揚勢頭，說明第1組樣品微生物群落活性較高。圖1～4

圖1 額敏沼液AWCD值
Fig. 1AWCD of Emin biogas slurry

圖2吐魯番沼液AWCD值
Fig. 2AWCD of Turpan biogas slurry

圖3特克斯沼液AWCD值
Fig. 3AWCD of Tekes biogas slurry

2.2沼液微生物群落代謝多樣性指數

依據這4 組樣品的碳源利用情況，綜合考慮其變化趨勢，選取光密度增加較快的第二個拐點96 h 的AWCD 值進行沼液微生物群落代謝多樣性的分析。

圖4水西溝沼液AWCD值
Fig. 4AWCD of Shuixigou biogas slurry

土壤微生物群落功能多樣性以Simpson、Shannon-Wiener和McIntosh 三種指數來表征[12]。其中Simpson 指數(D)用于評估某些最常見種的優勢度；Shannon-Wiener 指數(H’)用于評估物種的豐富度；McIntosh 指數(U)用于評估群落物種均勻度。結果表明，水西溝組微生物群落多樣性在這4組中相對較高，其中吐魯番2豐富度指數最高為4.057 6，其他三組中豐富度較高的有額敏4指數為3.993 9，特克斯2指數為3.987 8，特克斯6指數為4.050 6。表2

2.3沼液微生物群落代謝功能主成分分析

根據樣品平均顏色變化率曲線，前三組選擇培養96 h光密度值來進行主成分分析，水西溝組選擇培養48 h光密度值來進行主成分分析及相關性分析。通常取當特征值累積貢獻率達80%的主成分個數，以簡化原本復雜的多維樣本，為保留原始數據中的特征信息，選取方差貢獻率最高的前兩個主成分PC1和PC2進行主成分分析。

額敏組分析結果為，前3個特征值累積方差貢獻率為100%，特征值分別為14.4、12.6和3.94，方差貢獻率依次為46.6%、40.6%和12.8%。提取累積方差貢獻率為87.2%的前兩個主成分PC1和PC2，進行沼液微生物碳源利用主成分分析。結果表明，額敏4在PC1上與其他3個樣有較大差異，說明日常勤于維護的與疏于管理的沼液微生物在碳源利用上存在一定的差異。可能與新鮮原料的不斷補給有關。圖5

表2 沼液微生物多樣性指數
Table 2Diversity indices of Biogas slurry microbial

沼液樣品Sample平均吸光度AWCD優勢度指數Simpson(D)豐富度指數Shannon-Wiener(H’)均勻性指數McIntosh(U)e10.19061.05123.48141.0944e20.44090.97293.76640.941e30.04890.97293.76640.941e40.47340.98633.99390.9684tu10.05171.00413.74591.0087tu20.32910.99854.05760.9965tu30.43710.97543.85980.945tu40.46690.99583.40160.9921tu50.24430.99583.40160.9921TE10.17951.0153.28161.0257TE20.48790.98373.98780.9623TE30.24450.99183.42770.9847TE40.05240.99183.42770.9847TE50.28230.99863.40690.9972TE60.41420.99954.05060.9989s10.42931.01744.37711.0431s20.6811.00894.77071.0262s30.81581.00054.75961.0015

吐魯番組分析結果為，前4個特征值累積方差貢獻率為100%，特征值分別為11、8.9、7.1和3.8，方差貢獻率依次為35.5%、28.7%、23.1%和12.7%。提取累積方差貢獻率為64.3%的前兩個主成分PC1和PC2，進行沼液微生物碳源利用主成分分析。可以看出，吐魯番2和吐魯番4兩點非常接近，說明這兩個樣微生物碳源利用水平相似，結合戶用沼氣基本信息表判斷，這連個沼氣池停止產氣的原因是相似的，微生物碳源利用水平也基本相同。圖6

特克斯組分析結果為，前5個特征值累積方差貢獻率為100%，特征值分別為11.6、8.1、5.6、4.4和1.3，方差貢獻率依次為37.6%、26.1%、18%、14%和4.3%。提取累積方差貢獻率為63.7%的前兩個主成分PC1和PC2，進行沼液微生物碳源利用主成分分析。可以看出，從PC1和PC2的累積貢獻率只有63.7%，只能代表總信息權重的一半多一點，因此圖7所顯示的信息的參考價值相對更低一些。圖7

水西溝組分析結果為，前3個特征值累積方差貢獻率為100%，特征值分別為17.6、8.9和4.4，方差貢獻率依次為56.9%、28.7%和14.4%。提取累積方差貢獻率為85.6%的前兩個主成分PC1和PC2，進行沼液微生物碳源利用主成分分析。可見，水西溝1、2,、3號樣在PC1上均有較大差異，在PC2上水西溝2和3相似，總體評判，在碳代謝功能菌群結構方面，2、3號樣相似而有別于1號樣。推測與維護管理情況相關。圖8

圖5額敏沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 5 Principal component analysis onsubstrate utilization potential of microbialcommunity of Emin

圖6吐魯番沼液微生物碳源利用主成分分析

Fig. 6Principal component analysis on substrate utilization potential of microbial

community of Turpan

圖7特克斯沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 7 Principal component analysis onsubstrate utilization potential of microbialcommunity of Tekes

圖8水西溝沼液微生物碳源利用主成分分析
Fig. 8 Principal component analysis on substrate utilization potential of microbialcommunity of Shuixigou

對 PC1，PC2的得分系數與單一碳源的 AWCD 進行相關性分析，得出 31 種碳源在兩個主成分上的載荷值。主成分分析中的載荷因子可反映不同土壤碳代謝的差異,絕對值越大表明該基質的影響越大，由表3可知：表3

額敏組：在PC1 上具有較高載荷值的碳源共有9種(︱r︱﹥0.900)，包括 D-木糖、D-半乳糖醛酸、衣康酸、2-羥苯甲酸、α-D-乳糖、D-纖維二糖、葡萄糖-1-磷酸鹽、苯乙基胺、腐胺。在PC2 上具有較高載荷值的碳源有6種(︱r︱﹥0.900)， 包括 D-甘露醇、L-絲氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、D-葡萄胺酸、D-蘋果酸、D,L-α-甘油。

吐魯番組：在PC1 上具有較高載荷值的碳源有3種(︱r︱﹥0.900)， 包括 D-半乳糖內酯、甘氨酰-L-谷氨酸、α-丁酮酸。在PC2 上有較高載荷值的碳源有2種(︱r︱﹥0.900)，包括 β-甲基D-葡萄糖苷、衣康酸。

特克斯組：在PC1 上具有較高載荷值的碳源有4種(︱r︱﹥0.900) ，包括 D-半乳糖內酯、L-苯基丙氨酸、N-乙酰基-D-葡萄胺、腐胺。在PC2 上有較高載荷值的碳源有1種(︱r︱﹥0.900) ，α-丁酮酸。

水西溝組：在PC1 上具有較高載荷值的碳源有17種(︱r︱﹥0.900) 包括 β-甲基D-葡萄糖苷、L-精氨酸、D-木糖、4-羥基苯甲酸、D-半乳糖醛酸、吐溫40、α-環式糊精、I-赤藻糖醇、2-羥苯甲酸、D-甘露醇、L-絲氨酸、肝糖、D-葡萄胺酸、衣康酸、D-纖維二糖、苯乙基胺、α-D-乳糖。在PC2 上有3種較高載荷值的碳源(︱r︱﹥0.900)包括D-半乳糖內酯、甘氨酰-L-谷氨酸、D,L-α-甘油。

從每一組對PC1和PC2貢獻率較大的碳源組成上，沒有明顯的規律性，由此說明每個沼氣池的微生物群落結構差異較大，進而呈現出對碳源利用的多態性。

將以上四組合并做整體主成分分析，并以產氣情況劃分為產氣正常組和產氣較低組做碳源載荷值分析，分析結果顯示，各組樣品分散分布無明顯規律，在產氣正常組PC1上載荷值最高的碳源是D-甘露醇，其次是甘氨酰-L-谷氨酸，再次是 4-羥基苯甲酸。產氣較低組PC1上載荷值最高的碳源是α-D-乳糖，其次是D-木糖，再次是L-蘇氨酸。

3討 論

在正常產氣的沼液中，存在著種群繁多的微生物，目前針對沼液微生物生態的分析手段主要有：免培養的分子生物學方法和可培養的純培養方法，都有其自身的優勢和局限性，都會遺漏許多重要的沼液微生物學信息，因此無法以某一單一分析技術的研究結果來揭示沼液中微生物群落的全部生態信息。Biolog方法要求的勞動強度、技術含量都較低，只需對Biolog微平板進行無菌接種操作即可，并且可以在較短的時間內檢測較大量的樣品。該方法在研究微生物群落功能多樣性方面很有意義[14]，尤其適合同一樣品處理前后的對比分析。

表3沼液不同碳源在PC1 和PC2 上的載荷值
Table 3Correlation analysis of Biogas slurry different carbon source utilization with PC1 and PC2

碳源額敏(Emin)吐魯番(Turpan)特克斯(Tekes)水西溝(Shuixigou)(Carbonsource)PC1PC2PC1PC2PC1PC2PC1PC2β-甲基D-葡萄糖苷?-Methyl-D-Glucoside0.7850.61930.30970.9207-0.3317-0.03430.91810.0077D-半乳糖內酯D-GalactonicAcidy-Lactone-0.69330.14870.9919-0.05950.9155-0.27750.31180.9238L-精氨酸L-Arginine-0.24320.76780.34230.86790.77040.57580.97270.229丙酮酸甲脂PyruvicAcidMethylEster-0.7140.64070.5887-0.7210.6434-0.02980.88370.1742D-木糖D-Xylose-0.903-0.4252-0.7757-0.34450.5374-0.43660.9875-0.1558D-半乳糖醛酸D-GalacturonicAcid0.94820.29720.72050.37740.5717-0.3870.94690.0492L-天冬酰胺酸L-Asparagine-0.67540.64970.34050.8270.09050.49840.86820.2691吐溫40Tween400.76290.57870.8792-0.38940.26440.81760.9240.111I-赤藻糖醇I-Erythritol0.83130.22690.5493-0.75790.67010.34070.9767-0.2022-羥苯甲酸2-HydroxyBenzoicAcid0.95350.2783-0.66-0.29760.38550.7550.97660.2028L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine-0.55410.83230.8567-0.46640.94220.01090.7906-0.5631吐溫80Tween80-0.62880.55320.78390.57410.72090.13170.7465-0.5859D-甘露醇D-Mannitol-0.28840.91160.1993-0.40060.2108-0.07580.9336-0.28874-羥基苯甲酸4-HydroxyBenzoicAcid0.80510.13810.3009-0.12550.5192-0.28690.9287-0.1401L-絲氨酸L-Serine0.33320.9260.43990.70880.48940.61980.99150.1173α-環式糊精a-Cyclodextrin-0.58750.54160.7447-0.64290.04590.36690.97080.0749N-乙酰基-D-葡萄胺N-Acetyl-D-Glucosamine-0.11190.9910.71960.15470.95220.18620.8956-0.0968γ-羥基丁酸y-HydroxybutyricAcid-0.61040.711-0.53180.06090.8357-0.54550.4792-0.7744L-蘇氨酸L-Threonine-0.41730.86850.3922-0.35140.5722-0.80740.8864-0.3979肝糖Glycogen-0.3194-0.2637-0.0162-0.2575-0.37960.16680.9410.0622D-葡萄胺酸D-GlucosaminicAcid-0.25690.9540.41340.71050.40150.71590.9606-0.0361衣康酸ItaconicAcid0.9130.31410.34330.9059-0.7761-0.34730.95710.2014甘氨酰-L-谷氨酸Glycyl-L-GlutamicAcid-0.4350.86070.93680.11610.79260.60520.30190.9112D-纖維二糖D-Cellobiose0.94330.29210.08550.72770.38960.7550.95830.1203葡萄糖-1-磷酸鹽Glucose-1-Phosphate0.9010.42980.12990.60550.6936-0.59660.89690.3528α-丁酮酸a-KetobutyricAcid-0.52090.830.9561-0.13220.38650.91430.6564-0.7542苯乙基胺Phenylethyl-amine0.94560.30780.8381-0.47290.0587-0.73570.92460.1277α-D-乳糖a-D-Lactose0.95880.15490.8166-0.54410.7746-0.58020.9748-0.0064D,L-α-甘油D,L-a-Glycerol0.29920.92670.26670.30020.4621-0.2075-0.25090.9666D-蘋果酸D-MalicAcid0.05260.9881-0.06740.34550.7427-0.62490.75330.5858腐胺Putrescine0.95350.2783-0.02980.42850.9078-0.19910.88610.2969

從平均顏色變化率(AWCD)可以看出，各組樣品間微生物活性差異顯著。多樣性分析顯示，水西溝組的Shannon指數較高。正常產氣的沼液中均有豐富的好氧菌，底物原料越豐富投料量越大的，AWCD值越高，這與徐慶賢等[5]以PCR-DGGE方法，研究表明，沼氣池中具有豐富的微生物種群，并在不同發酵層次和發酵時間存在差異性和優勢種群的結論相一致。多樣性分析結果顯示，每組微生物豐富度存在差異，主成分分析及與碳源相關性分析顯示各組沼液在PC1和PC2上做出最大貢獻率的碳源各不相同，說明微生物群落結構存在較大差異，并導致了不同的代謝功能差異。

4結 論

北疆地區戶用沼氣微生物群落在碳代謝水平上多樣性顯著，各組沼液微生物群落有很高的豐富度，各組樣品間微生物代謝活性差異顯著，但地域性差別不明顯。

沼液微生物群落結構多樣性影響了代謝功能的多樣性及產氣的穩定性，結合數據分析結果和戶用沼氣實地調查情況發現，對沼氣池及相關裝備的維護保養及原料的及時更新也是影響沼氣使用價值的重要因素。

趙家祥在《必然王國與自由王國的含義及其關系》這篇文章中，分析并融合了關于馬克思必然王國與自由王國之關系的多種角度的理解，他的觀點可以說涵蓋了關于馬克思自由勞動概念的多種理解路徑。分析趙家祥的文章有利于我們對馬克思自由王國這個主題進行聚焦，便于澄清馬克思的自由勞動概念。趙家祥認為必然王國有兩種含義，自由王國也有兩種含義。在他看來，必然王國與自由王國既可以是兩個不同的人類實踐領域，也可以是不同的兩個人類歷史時期。

研究嘗試將Biolog微平板技術，應用于探析沼液微生物多樣性方面。另外，由于研究采用Biolog方法還存在著一定的局限性[15]，只能觀測到好氧微生物的碳源利用信息，對厭氧微生物菌群未做分析，還需結合一些其他測定微生物多樣性的方法來進一步明確微生物群落功能多樣性。

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Microbial Community Diversity Analysis of Biogas Slurry from Households in Northern Xinjiang

CHEN Jing，DAI Jin-ping，YANG Xin-ping，Guli Ahmat，Marhaba， FENG Lei

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences, /XinjiangSpecialEnvironmentalMicrobiologyLaboratory,Urumqi, 830091,China)

Abstract：【Objective】 Comparison of the functions of biogas digesters microbial community diversity in the region from different angles of carbon metabolism.【Method】In Northern Xinjiang household biogas as the research object, use the Biolog micro tablet technology, with the DPS data processing software parsing from four different areas of Northern Xinjiang biogas slurry microbial community diversity of carbon metabolism.【Result】From the rate of change from the average color (AWCD) it could be seen that all samples displayed significant difference between microbial activity. The diversity analysis demonstrated that Shannon index in Shuixigou group was higher. Principal component analysis showed that the biogas slurry the carbon source utilization of the microbial community characteristics showed obvious difference. Among them, the main differentiation in PC1 and PC2 carbon source was also different.【Conclusion 】 The data analysis results told us that the microbial community richness was very high, and there were obvious differences, but the regional difference was not obvious.

Key words:biogas slurry; microbial diversity; biolog ecological plate；carbon metabolism

中圖分類號：S188

文獻標識碼：A

文章編號：1001-4330(2016)03-0539-08

作者簡介:陳競(1981-)，男，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，助理研究員,研究方向為生物質能源綜合利用,(E-mail)592393697@qq.com通訊作者:馮蕾(1967-)，女，新疆烏魯木齊人，博士,研究方向為生物能源,(E-mail)fl_xj03@sina.com

基金項目:國家自然科學基金項目(31260016)；新疆維吾爾自治區重大專項(201130104)

收稿日期：2015-09-09

doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.03.021

Fund project:Supported by NSFC (31260016) and the special fund for major scientific and technological research of Xinjiang Uygur Autonomous Region (201130104)